本发明专利技术涉及一种低电位抗体定向捕获型免疫传感器的制备方法及应用，该发明专利技术属于纳米材料与免疫分析技术领域；本发明专利技术以牛血清蛋白BSA还原的金纳米簇Au25作为基底材料和电致发光体，以C‑反应蛋白CRP作为目标分析物，通过共价交联结合抗体定向捕获剂HWRGWVC，提出了一种抗体定向固定传感策略。以BSA‑Au25/HWRGWVC作为传感平台构建的无标记型ECL免疫传感器，抗体捕获率以及活性较传统模式有明显的提升，同时该传感器有着超高的灵敏度以及极低的检测限，在免疫分析领域有着广阔的应用前景。
Preparation and Application of a Low Potential Antibody Directional Capture Immunosensor
【技术实现步骤摘要】
一种低电位抗体定向捕获型免疫传感器的制备方法及应用
本专利技术属于新型电致发光传感器与免疫分析领域。
技术介绍
急性细菌感染严重威胁着人的生命健康安全，临床上往往因为无法短时间判断感染类型而造成患者死亡。相关报道指出，C-反应蛋白CRP在机体的天然免疫中发挥着重要租用，尤其是在机体受到感染或者组织损伤时其在血浆中的浓度急剧上升，是一种非特异性的炎症标志物，同时它与动脉瓣样硬化等心血管疾病有关，是心血管疾病最强有力的预示因子与危险因子。因此，实现人体血清中CRP的快速灵敏检测对人体急性细菌感染的判断以及心血管疾病的预防有着重要的作用。目前对CRP检测普遍运用的手段是电化学免疫传感器，在酶联免疫的基础上通过与纳米材料等具有电化学性能的材料结合，将其浓度以电信号或者光信号的形式体现出来。虽然抗体随机结合模式下构建的免疫传感器效果不错，但仍然无法实现免疫分析中的超低灵敏度与检测限。本专利技术在现有研发的基础上，提出抗体定向固定策略并实施，旨在为CRP的超灵敏检测提供一种全新的思路。
技术实现思路
本专利技术的技术任务之一是为了弥补现有免疫传感器技术的不足，提供一种抗体定向捕获型免疫传感器的制备方法。该方法本着传感器构建简单高效的原则，摆脱了传统免疫传感器构建中以材料为核心的设计理念，利用BSA还原氯金酸合成的金纳米簇作为基底材料和电致发光体，直接负载抗体定向捕获物HWRGWVC，通过该物质对抗体Fc片段的特异性识别，实现抗体的定向捕获。该方法所用原料成本低，制备工艺简单，反应耗能低，在免疫分析领域有着广阔的应用前景。本专利技术的技术任务二是提供所述免疫传感器的用途，该传感器能够快速检测CRP，灵敏度高，检出限低，重现性好，在CRP以及其他疾病标志物的临床检测中有着广阔的应用前景。为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案如下：1.一种低电位抗体定向捕获型免疫传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将玻碳电极分别在乙醇和去离子水中超声清洗30s，依次用1.0μm,0.3μm和0.05μm的Al2O3抛光粉对其抛光使之类似镜面般光滑，用氮气吹干；(2)将6μL分散均匀、浓度为1~3mg/mL的BSA-Au25溶液滴涂至玻碳电极表面，室温下自然晾干；(3)将上述晾干的玻碳电极插入5~10μg/mL的HWRGWVC溶液中，于4oC下孵化30min，超纯水洗净，室温下自然晾干；(4)滴加6μL质量分数为0.1%的牛血清蛋白溶液，使之封闭非特异性活性位点，用pH7.4的磷酸盐缓冲溶液冲洗电极表面，室温下自然晾干；(5)滴加6μL浓度为1~2μg/mL的anti-CRP标准溶液，于4oC下孵化1h，用pH7.4的磷酸盐缓冲溶液冲洗电极表面，4oC晾干；(6)滴加6μL未知浓度的CRP溶液，于4oC下孵化1h，用pH7.4的磷酸盐缓冲溶液冲洗电极表面，4oC晾干，传感器构建完毕。2.所述的一种低电位抗体定向捕获型免疫传感器的制备方法，所述基底材料BSA-Au25溶液，按以下步骤制备：室温下，将5mL、浓度为5~10mmol/L的氯金酸溶液与5mL、浓度为50~100mg/mL的牛血清蛋白溶液充分混合，剧烈搅拌2~5min后，加入0.5~1mL、浓度为1~2mol/L的氢氧化钠溶液，然后将该混合液置于37oC水浴中12h，直至溶液颜色由淡黄色变为棕黄色，此时，氯金酸根离子已被BSA成功还原，得到BSA包覆的由25个金原子构成的金纳米簇BSA-Au25。3.所述的一种低电位抗体定向捕获型免疫传感器的制备方法，其特征在于，所述CRP为人体急性细菌感染以及动脉粥样硬化的标志物。4.所述的一种低电位抗体定向捕获型免疫传感器的制备方法制备的免疫传感器用于检测CRP的浓度。5.所述的检测CRP的浓度，其特征在于，检测步骤如下：(1)使用电化学工作站的三电极体系作为激发源，Ag/AgCl电极作为参比电极，铂电极作为对电极，所制备的电致发光传感器作为工作电极，将电化学工作站和超微弱光检测仪联用，光电倍增管高压设置为600V，循环伏安扫描电位为0~1.2V，扫速为150mV/s.(2)在10mL、pH7.8的含浓度为50~80mmol/L三乙胺磷酸缓冲液中，通过电致发光系统，检测在一系列不同浓度的待测物抗原修饰状态下传感器的电致发光信号强度，绘制工作曲线；(3)将实际血清样品代替待测抗原进行检测。本专利技术的有益成果(1)首次基于BSA还原氯金酸制备了BSA包裹的由25个金原子构成的金纳米簇，在三乙胺环境下，其电致发光点位低至0.6V，该电压下能够有效保护抗原抗体活性，同时，其稳定的电致发光效率以及易于修饰的外层结构，大大提升了其在免疫分析中的应用价值；(2)本专利技术首次以BSA-Au25/HWRGWVC作为传感平台构建了一种无标记型免疫传感器，在七肽HWRGWVC存在的情况下，该传感器捕获抗体的效率提升600%以上，灵敏度极大提升，检出限低至19.95fg/mL，为CRP以及其他疾病标志物的临床检测开辟了一种新方法。具体实施方式下面结合具体实施例，进一步阐述本专利技术，应理解，这些实施例仅用于说明本专利技术而不用于限制本专利技术的范围。实施例1.一种低电位抗体定向捕获型免疫传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将玻碳电极分别在乙醇和去离子水中超声清洗30s，依次用1.0μm,0.3μm和0.05μm的Al2O3抛光粉对其抛光使之类似镜面般光滑，用氮气吹干；(2)将6μL分散均匀、浓度为1mg/mL的BSA-Au25溶液滴涂至玻碳电极表面，室温下自然晾干；(3)将上述晾干的玻碳电极插入5μg/mL的HWRGWVC溶液中，于4oC下孵化30min，超纯水洗净，室温下自然晾干；(4)滴加6μL质量分数为0.1%的牛血清蛋白溶液，使之封闭非特异性活性位点，用pH7.4的磷酸盐缓冲溶液冲洗电极表面，室温下自然晾干；(5)滴加6μL浓度为1μg/mL的anti-CRP标准溶液，于4oC下孵化1h，用pH7.4的磷酸盐缓冲溶液冲洗电极表面，4oC晾干；(6)滴加6μL未知浓度的CRP溶液，于4oC下孵化1h，用pH7.4的磷酸盐缓冲溶液冲洗电极表面，4oC晾干，传感器构建完毕。实施例2.一种低电位抗体定向捕获型免疫传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将玻碳电极分别在乙醇和去离子水中超声清洗30s，依次用1.0μm,0.3μm和0.05μm的Al2O3抛光粉对其抛光使之类似镜面般光滑，用氮气吹干；(2)将6μL分散均匀、浓度为2mg/mL的BSA-Au25溶液滴涂至玻碳电极表面，室温下自然晾干；(3)将上述晾干的玻碳电极插入7.5μg/mL的HWRGWVC溶液中，于4oC下孵化30min，超纯水洗净，室温下自然晾干；(4)滴加6μL质量分数为0.1%的牛血清蛋白溶液，使之封闭非特异性活性位点，用pH7.4的磷酸盐缓冲溶液冲洗电极表面，室温下自然晾干；(5)滴加6μL浓度为1.5μg/mL的anti-CRP标准溶液，于4oC下孵化1h，用pH7.4的磷酸盐缓冲溶液冲洗电极表面，4oC晾干；(6)滴加6μL未知浓度的CRP溶液，于4oC下孵化1h，用pH7.4的磷酸盐缓冲溶液冲洗电极表面，4oC晾干，传感器构建完毕。实施例3.一种低电位抗体定向捕获型免疫传本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种低电位抗体定向捕获型免疫传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1) 将玻碳电极分别在乙醇和去离子水中超声清洗30 s，依次用1.0 μm, 0.3 μm和0.05 μm的Al2O3抛光粉对其抛光使之类似镜面般光滑，用氮气吹干；(2) 将6 μL分散均匀、浓度为1 ~ 3 mg/mL的BSA‑Au25溶液滴涂至玻碳电极表面，室温下自然晾干；(3) 将上述晾干的玻碳电极插入5 ~ 10 μg/mL的HWRGWVC溶液中，于4
【技术特征摘要】
1.一种低电位抗体定向捕获型免疫传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将玻碳电极分别在乙醇和去离子水中超声清洗30s，依次用1.0μm,0.3μm和0.05μm的Al2O3抛光粉对其抛光使之类似镜面般光滑，用氮气吹干；(2)将6μL分散均匀、浓度为1~3mg/mL的BSA-Au25溶液滴涂至玻碳电极表面，室温下自然晾干；(3)将上述晾干的玻碳电极插入5~10μg/mL的HWRGWVC溶液中，于4oC下孵化30min，超纯水洗净，室温下自然晾干；(4)滴加6μL质量分数为0.1%的牛血清蛋白溶液，使之封闭非特异性活性位点，用pH7.4的磷酸盐缓冲溶液冲洗电极表面，室温下自然晾干；(5)滴加6μL浓度为1~2μg/mL的anti-CRP标准溶液，于4oC下孵化1h，用pH7.4的磷酸盐缓冲溶液冲洗电极表面，4oC晾干；(6)滴加6μL未知浓度的CRP溶液，于4oC下孵化1h，用pH7.4的磷酸盐缓冲溶液冲洗电极表面，4oC晾干，传感器构建完毕。2.如权利要求1所述的一种低电位抗体定向捕获型免疫传感器的制备方法，所述基底材料BSA-Au25溶液，按以下步骤制备：室温下，将5mL、浓度为5~10mmol/L的氯金酸溶液与5mL、浓度为50~100...
【专利技术属性】
技术研发人员：魏琴，贾越，杨磊，冯瑞卿，
申请(专利权)人：济南大学，
类型：发明
国别省市：山东,37
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