糖尿病诊断、筛查与风险预测的方法、标志物与试剂盒技术

本发明专利技术公开了诊断、筛查和预测糖尿病发生的DNA甲基化标志物，所述标志物是基因VDR中的如下第(1)至第(7)组的七个CpG位点发生甲基化：(1)34(基于SEQ ID NO.1)；(2)83:87(基于SEQ ID NO.1)；(3)191:195(基于SEQ ID NO.1)；(4)245(基于SEQ ID NO.1)；(5)272(基于SEQ ID NO.1)；(6)423(基于SEQ ID NO.1)；(7)102(基于SEQ ID NO.2)。本发明专利技术还公开了检测所述DNA甲基化标志物的探针、方法和试剂盒，以及利用上述DNA甲基化位点的数据预测糖尿病发生风险的计算机模块。

Methods, markers and kits for diabetes diagnosis, screening and risk prediction

【技术实现步骤摘要】
糖尿病诊断、筛查与风险预测的方法、标志物与试剂盒
本专利技术涉及疾病检测领域；更具体而言，本专利技术涉及一种通过外周血细胞DNA甲基化检测进行糖尿病诊断、筛查与风险预测的方法、标志物与试剂盒。
技术介绍
根据中华医学会糖尿病分会2014年报告，我国是全球糖尿病第一大国，目前至少拥有9200万糖尿病患者。与美国、英国同期相比，我国糖尿病的增长速度也十分惊人，糖尿病发展速度是全球第一。“高速增长”意味着，将来每年可能会有几百万的糖尿病患者进入糖尿病并发症高发时期，对国家、病人家庭带来的经济负担十分巨大。从基因层面，尤其是表观遗传学层面研究糖尿病，筛选糖尿病相关的基因位点，研究糖尿病发病机制和进展，研究基因调控与糖尿病并发症的关系，可对糖尿病的预防、控制与治疗提供可能的解决方案，对糖尿病的防治具有重要意义。在众多糖尿病患者(二型糖尿病)中，因不良生活习惯和环境因素等导致的后天病变人群占有相当大的比例。以体液(包括血液、唾液)DNA甲基化为代表的表观遗传学信息，由于可以动态地反映遗传背景、环境暴露、生活习惯对人体的综合影响，被认为是在动态健康风险管理方面最有价值的数据源之一。从DNA甲基化角度开发糖尿病诊断、筛查和风险预警应用，一方面可以从表观遗传学角度深入揭示环境因素引发糖脂代谢紊乱、最终导致糖尿病病变的科学机理，另一方面可发现糖尿病发病前的遗传学信息，为受到不良生活习惯和环境因素影响的糖尿病高危人群进行健康预警服务，为提醒其采取预防措施、避免糖尿病病变提供支持。
技术实现思路
专利技术人通过SequenomMassARRAY甲基化DNA定量分析技术研究糖尿病患者外周血细胞VDR基因甲基化水平与糖尿病发生的关联，探讨其与糖尿病发生、作为早期筛查标志物的应用前景。经过努力，发现了人的血液中基因VDR转录起始点前后序列中的多个DNA甲基化位点与糖尿病发生显著相关。因此，在第一方面，本专利技术提供了糖尿病诊断、筛查与风险预测的DNA甲基化标志物，所述标志物是基因VDR中的如下第(1)至第(7)组所示的七个CpG位点发生甲基化：(1)34(基于SEQIDNO.1)；(2)83:87(基于SEQIDNO.1)；(3)191:195(基于SEQIDNO.1)；(4)245(基于SEQIDNO.1)；(5)272(基于SEQIDNO.1)；(6)423(基于SEQIDNO.1)；(7)102(基于SEQIDNO.2)；其中，所述序列中碱基的编号是基于SEQIDNO.1和基于SEQIDNO.2中所示序列中的碱基的编号，其中，各序列中第1个碱基的位置为1。在一个实施方案中，所述VDR基因的核苷酸序列参见Genbank数据库(GeneID:7421)。在一个实施方案中，所述DNA甲基化标志物位于SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示的核苷酸区段中。在第二方面，本专利技术提供了用于检测权利要求1所述的DNA甲基化标志物的引物对，所述引物对扩增含有权利要求1所述的第(1)组至第(7)组的DNA甲基化标志物的序列。在一个实施方案中，所述引物对为扩增SEQIDNO.1和SEQIDNO.2的引物对。在一个实施方案中，所述引物对为SEQIDNO.3和SEQIDNO.4、SEQIDNO.5和SEQIDNO.6。在一个实施方案中，本专利技术提供了一种检测本专利技术第一方面所述的DNA甲基化标志物的方法，所述方法包括1)提取DNA样品，2)对所述DNA样品进行亚硫酸盐处理，3)用本专利技术第二方面所述的引物对扩增所述亚硫酸盐处理的样品，获得扩增产物，4)对所述扩增产物进行消化(例如采用SAP酶)，5)对所述消化后的扩增产物进行转录和酶切，6)采用质谱方法对所述转录和酶切产物进行检测，获得样品序列中本专利技术的第一方面所述的DNA甲基化标志物的甲基化情况。在一个实施方案中，在5)中包括对所述转录和酶切产物进行纯化。在一个实施方案中，所述质谱方法是飞行质谱方法。在第四方面，本专利技术提供了一种DNA甲基化标志物检测试剂盒，所述试剂盒包括本专利技术的第二方面所述的引物对；或者所述试剂盒包括涵盖本专利技术第一方面中所述的甲基化位点的探针序列，其中本专利技术的CpG位点中的C保持不变或者被T替换。在第四方面，本专利技术提供了一种利用本专利技术第一方面所述DNA甲基化位点的数据预测糖尿病发生风险的计算机模块，所述计算机模块包括：DNA甲基化值情况接收模块、数据存储模块、用于诊断、筛查与预测糖尿病发生风险的处理器模块和用于输出结果的输出模块，其中，所述数据存储模块存储接收到的数据、本专利技术第一方面所述的CpG甲基化情况，所述用于预测糖尿病发生风险的处理模块将所接收的DNA甲基化情况与本专利技术第一方面所述的CpG甲基化情况进行比较。在第五方面，本专利技术提供了一种利用本专利技术的第一方面所述DNA甲基化标志物或者本专利技术的第二方面所述的引物对在糖尿病诊断、筛查与风险预测中的应用，例如在制备用于糖尿病诊断、筛查与风险预测的试剂中的应用。在第六方面，本专利技术提供了一种采用基因芯片对基因组中序列为SEQIDNO.1和SEQIDNO.2的片段进行检测的方法。优选地，所述检测包括对基因组中序列为SEQIDNO.1和SEQIDNO.2的片段进行CG位点甲基化情况的检测。本专利技术对基因VDR中两个区段的甲基化与糖尿病之间的相关性进行评估，设计了一对引物，该引物扩增的DNA序列中覆盖了个DNA甲基化位点，利用此引物可对其中的DNA甲基化位点进行检测，评估糖尿病的发生风险。本专利技术的方法有如下优点：1)本专利技术选择检测的甲基化位点分布于基因VDR的两个区段的序列上，与糖尿病发生显著相关，可对发生糖尿病的风险进行预测。2)本方法具有检测方便，成本低廉、高通量的特点，适合推广。附图说明图1：基于SEQIDNO.1各显著差异位点在糖尿病和对照组之间的箱线图。图2：基于SEQIDNO.2显著差异位点在糖尿病和对照组之间的箱线图。图3：基于SEQIDNO.1中显著差异位点的糖尿病预测综合模型ROC性能曲线。图4：基于SEQIDNO.1和SEQIDNO.2中显著差异位点的糖尿病综合预测模型ROC性能曲线。具体实施方式维生素D受体(VDR)是炎症和B细胞存活的关键调节剂。II型糖尿病(T2D)进展的主要原因是炎性应激和胰岛素抵抗引起的B细胞功能障碍。由胰岛素抵抗引发的B细胞功能障碍导致胰岛素分泌缺陷，内质网应激，最终引起B细胞丢失和疾病进展。机制上，配体促进VDR与PBAF的结合，从而影响染色质可及性和增强全基因组变化，导致抗炎反应的发生。在小鼠T2D模型中，BRD9的抑制作用可促进PBAF-VDR缔合以恢复B细胞功能并改善高血糖症。这些研究揭示了支持B细胞存活的VDR依赖性转录程序，并将VDR-PBAF/BAF关联鉴定为潜在T2D的治疗靶点。本专利技术人发现，基因VDR中两个区段的序列如下位置的CpG组中，第(1)组至第(7)组：(1)34(基于SEQIDNO.1)；(2)83:87(基于SEQIDNO.1)；(3)191:195(基于SEQIDNO.1)；(4)245(基于SEQIDNO.1)；(5)272(基于SEQIDNO.1)；(6)423(基于SEQIDNO.1)；(7)102(基于SEQIDNO.2)；(所述序列中碱基位置的编号是分别基于SEQID本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.糖尿病诊断、筛查与风险预测的DNA甲基化标志物，其中，所述标志物是基因VDR中的如下第(1)至第(7)组所示的七个CpG位点发生甲基化：(1)34(基于SEQ ID NO.1)；(2)83:87(基于SEQ ID NO.1)；(3)191:195(基于SEQ ID NO.1)；(4)245(基于SEQ ID NO.1)；(5)272(基于SEQ ID NO.1)；(6)423(基于SEQ ID NO.1)；(7)102(基于SEQ ID NO.2)；其中，所述序列中碱基的编号是基于SEQ ID NO.1和基于SEQ ID NO.2中所示序列中的碱基的编号，其中，各序列中第1个碱基的位置记为1。

【技术特征摘要】
1.糖尿病诊断、筛查与风险预测的DNA甲基化标志物，其中，所述标志物是基因VDR中的如下第(1)至第(7)组所示的七个CpG位点发生甲基化：(1)34(基于SEQIDNO.1)；(2)83:87(基于SEQIDNO.1)；(3)191:195(基于SEQIDNO.1)；(4)245(基于SEQIDNO.1)；(5)272(基于SEQIDNO.1)；(6)423(基于SEQIDNO.1)；(7)102(基于SEQIDNO.2)；其中，所述序列中碱基的编号是基于SEQIDNO.1和基于SEQIDNO.2中所示序列中的碱基的编号，其中，各序列中第1个碱基的位置记为1。2.用于检测权利要求1所述的DNA甲基化标志物的引物对，其中，所述引物对扩增含有权利要求1所述的第(1)组至第(7)组的DNA甲基化标志物的序列。3.根据权利要求2的引物对，其中，所述引物对用于扩增SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示的核苷酸区段。4.根据权利要求2或3的引物对，其中，所述引物对为SEQIDNO.3，SEQIDNO.4，SEQIDNO.5和SEQIDNO.6。5.检测权利要求1所述的DNA甲基化标志物的方法，其中，所述方法包括1)提取DNA样品，2)对所述DNA样品进行亚硫酸盐处理，3)用权利要求2-4任一项所述的引物对扩增所述亚硫酸盐处理的样品，获...

【专利技术属性】
技术研发人员：熊江辉，梁峰吉，陈颖，
申请(专利权)人：深圳市绿航星际太空科技研究院，
类型：发明
国别省市：广东,44