一种利用α-1抗蛋白酶评价铀矿粉尘内照射生物损伤的方法技术

本发明专利技术涉及一种利用α‑1抗蛋白酶评价铀矿粉尘内照射生物损伤的方法。利用WISTAR大鼠肺组织中α‑1抗蛋白酶对铀矿粉尘内照射造成的生物损伤非常敏感的特性，根据WISTAR大鼠接受气管滴注的铀矿粉尘混悬液的量与肺组织中α‑1抗蛋白酶相对表达量的上调率的剂量‑效应关系，通过WISTAR大鼠肺部组织中α‑1抗蛋白酶的相对表达量的上调率，评估铀矿粉尘内照射造成的生物损伤。本方法具有对铀矿粉尘内照射造成的生物损伤敏感性高、特异性强、可靠性好等多重优点。

A Method for Evaluating Biological Damage Induced by Uranium Mine Dust by Using alpha-1 Antiproteinase

【技术实现步骤摘要】
一种利用α-1抗蛋白酶评价铀矿粉尘内照射生物损伤的方法
本专利技术属于铀矿粉尘内照射生物损伤评价
，利用分子标记物进行铀矿粉尘内照射生物损伤评价的方法，具体是利用WISTAR大鼠肺组织中α-1抗蛋白酶的相对表达量上调率来评价铀矿粉尘内照射生物损伤的方法。
技术介绍
在铀矿勘探、开采、水冶和尾矿处置过程中都会产生一定数量的铀矿粉尘污染，这些铀矿粉尘中含有铀、钍、镭等放射性核素，一旦被人体吸进体内，就会长时间滞留于肺气管、支气管和淋巴结内，构成潜在的长期内照射危害，产生生物损伤。铀矿尘的电离辐射主要来自于氡及其子体(218Po、214Pb、214Bi和214Po)衰变产生的α、β射线，由于吸入的粉尘产生的放射性剂量低，短时间内很难表现出生物效应，因而难以进行检测和生物损伤评估。因此，筛选出对铀矿粉尘内照射造成的生物损伤检测速度快、敏感性高、特异性强、可靠性好的生物标志物，对具有十分重要的意义。生物体吸入铀矿粉尘后，可能通过改变蛋白质的表达水平及其翻译后修饰状态来响应电离辐射。iTRAQ技术是新兴的高通量蛋白质组学方法，通过特异性标记多肽的氨基基团，然后进行串联质谱分析，可同时比较4种或8种不同样品中蛋白质的相对含量或绝对含量。因此，可以通过iTRAQ技术筛选组织样品中差异表达的蛋白质来确定与铀矿粉尘内照射造成的生物损伤相关的生物标志物，进而采用筛选的生物标志物对铀矿粉尘内照射造成生物损伤进行评价。
技术实现思路
针对上述情况，本专利技术提供一种利用WISTAR大鼠肺组织中α-1抗蛋白酶(Alpha-1-antiproteinase，A1AT)的相对表达量上调率来评价铀矿粉尘内照射造成的生物损伤的方法。本专利技术利用WISTAR大鼠肺组织中α-1抗蛋白酶对铀矿粉尘内照射造成的生物损伤非常敏感的特性，根据WISTAR大鼠接受气管滴注的铀矿粉尘混悬液（铀矿粉尘与生理盐水按照一定比例配置）的量与肺组织中α-1抗蛋白酶相对表达量的上调率的剂量-效应关系，通过WISTAR大鼠肺部组织中α-1抗蛋白酶的相对表达量的上调率，评估铀矿粉尘内照射造成的生物损伤。其原理是，专利技术人通过iTRAQ技术筛选发现接受气管滴注的铀矿混悬液后WISTAR大鼠肺部组织中的α-1抗蛋白酶的相对表达量对铀矿粉尘非常敏感，且存在一定的剂量-效应关系。α-1抗蛋白酶是血浆浓度响应炎症而变化的蛋白质，参与氧化应激，炎症反应和细胞凋亡。在一定的内照射剂量范围内，机体受到的内辐照损伤越大，α-1抗蛋白酶的相对表达量就越高，α-1抗蛋白酶蛋白表达的高低直接与铀矿粉尘内照射造成的生物损伤程度密切相关，该方法具有对铀矿粉尘内照射造成的生物损伤敏感性高、特异性强、可靠性好等多重优点。具体步骤是：（1）建立铀矿混悬液气管滴注WISTAR大鼠模型；（2）采集肺组织；（3）α-1抗蛋白酶相对表达量上调率的检测；（4）内照射生物损伤综合评价。其进一步的措施是：所述的建立铀矿混悬液气管滴注WISTAR大鼠模型的具体方法是：选择体重在180-220g之间的WISTAR成年雄性大鼠，随机分4组，每组6只老鼠，对照组气管滴注生理盐水和二氧化硅的悬液（二氧化硅的粒径为200目），实验组分别气管滴注浓度为1.25、2.5和5.0mg/ml的铀矿粉尘悬液（铀矿粉尘的粒径为200目），每次滴注0.2ml，一周滴注3次，连续5周。所述的采集肺组织的具体方法是：用颈椎脱臼法处死大鼠，解剖后取肺组织，把各组织分成3等份，用生理盐水冲洗掉血水，除去水分，装到冻存管内，马上放入-80℃冰箱保存。所述的α-1抗蛋白酶相对表达量上调率的检测具体方法是：将收集的接受过铀矿粉尘内照射WISTAR大鼠肺部组织进行蛋白提取、总蛋白浓度测定、蛋白质变性、凝胶电泳、转膜、免疫反应、化学发光反应、凝胶成像扫描分析、最后进行α-1抗蛋白酶的相对表达量上调率分析。所述的蛋白提取具体步骤如下：在研钵中倒入液氮预冷，迅速取出肺部组织样品，把组织切至均匀置于研钵中，马上加入液氮，进行研磨。在研钵中慢慢加入800μlLB裂解液，裂解30min，振荡1-2次，充分裂解。裂解结束后，收集1.5mL的悬液到EP管中，然后在4℃下，转速12000r/min，离心20min后，收集上清液。用树脂沉淀上清液中的蛋白，4℃，12000r/min离心20min，去掉上清，晾干，-80℃保存备用。在干燥后的蛋白质团块中加入200-250μLL3裂解液，用枪头反复吹打直至蛋白质充分分散。超声助溶，4℃，12000r/min，离心20min，吸出上清液，转移至新的EP管中。所述总蛋白浓度测定的具体步骤如下：将0.2mg/ml的BSA标准品溶液加稀释液，依次稀释成0、5、10、20、50、100、150和200μg/ml的标准品溶液。然后测定它们在562nm下的吸光度值，绘制标准曲线。测定每个样品溶液在562nm下的吸光度值后，再通过标准曲线计算出样品中蛋白质的浓度。所述蛋白质变性的具体步骤如下：将蛋白质溶液按照4:1的比例加入5×蛋白质上样缓冲液，沸水浴变性15min，放入-20℃冰箱保存备用。所述凝胶电泳的具体步骤如下：将30％丙烯酰胺、1.5MTRIS－HCl、10％SDS、10%过硫酸铵和TEMED按照一定比例配制成10%的分离胶和5%的浓缩胶；待分离胶凝固后，在电泳槽中加入电泳液，将变性后的蛋白质样品加入电泳孔中，进行电泳。将浓缩胶电压调至75V，分离胶电压调至100V，电泳至溴酚蓝刚跑至分离胶底部，即可终止电泳，进行转膜。所述转膜的具体步骤如下：先采用甲醇将PVDF膜进行活化，再在膜的底部放置5-6张7×9cm的滤纸，再一同放置于转膜仪中，加入转膜液，300mA恒流转膜30min。转膜过程中，将转膜槽放置于冰水中降温。所述免疫反应的具体步骤如下：将转好的膜用5%的脱脂牛奶（0.5%TBST稀释）封闭，在脱色摇床上混匀1h。采用TBST溶解的5%脱脂牛奶对α-1抗蛋白酶一抗（Alah3al）进行1:1000浓度稀释，然后将其与封闭好的膜进行混匀，4℃下孵育过夜。用2%TBST对α-1抗蛋白酶一抗孵育过夜的膜进行清洗，室温下在脱色摇床上清洗3次，每次5min。最后用TBST对二抗（羊抗兔）稀释8000倍，室温下孵育1.5h后，在脱色摇床上清洗三次，每次10min。所述化学发光反应的具体步骤如下：在暗室中将ECLA和ECLB两种试剂在离心管中等体积混合，将PVDF膜的蛋白面朝上，加入混合好的ECL溶液充分反应1-2min后，放入凝胶成像系统进行扫描分析。所述的凝胶成像扫描分析的具体步骤如下：采用凝胶成像系统对蛋白条带进行拍照，再采用ImageJ软件分析目标带的灰度值。通过对α-1抗蛋白酶蛋白灰度值扫描获得α-1抗蛋白酶蛋白表达量，对内参蛋白GAPDH蛋白灰度值扫描获得GAPDH蛋白表达量；将α-1抗蛋白酶蛋白表达量除以内参蛋白GAPDH蛋白表达量即获得α-1抗蛋白酶的相对表达量。所述α-1抗蛋白酶的相对表达量上调率分析的具体步骤如下：α-1抗蛋白酶(A1AT)相对表达量上调率按公式（1）进行计算：（1）所述内照射生物损伤综合评价的具体方法是：采用α-1抗蛋白酶的相对表达量上调率来评价铀矿粉尘内照射造成的生物损伤。当WISTAR大鼠肺部组织本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种利用α‑1抗蛋白酶评价铀矿粉尘内照射生物损伤的方法，根据WISTAR大鼠接受气管滴注的铀矿粉尘混悬液的量与肺组织中α‑1抗蛋白酶相对表达量的上调率的剂量‑效应关系，通过WISTAR大鼠肺部组织中α‑1抗蛋白酶的相对表达量的上调率，评估铀矿粉尘内照射造成的生物损伤，其特征在于，具体步骤是：（1）建立铀矿混悬液气管滴注WISTAR大鼠模型；（2）采集肺组织；（3）α‑1抗蛋白酶相对表达量上调率的检测；（4）内照射生物损伤综合评价；所述的建立铀矿混悬液气管滴注WISTAR大鼠模型的具体方法是：选择体重在180 ‑ 220 g之间的WISTAR成年雄性大鼠，分4组，每组6只老鼠，对照组气管滴注生理盐水和二氧化硅的悬液，实验组分别气管滴注浓度为1.25、2.5和5.0 mg/ml的铀矿粉尘悬液，每次滴注0.2 ml，一周滴注3次，连续5周；所述的采集肺组织的具体方法是：用颈椎脱臼法处死大鼠，解剖后取肺组织，把各组织分成3等份，用生理盐水冲洗掉血水，除去水分，装到冻存管内，马上放入‑80℃冰箱保存；所述的α‑1抗蛋白酶相对表达量上调率的检测具体方法是：将收集的接受过铀矿粉尘内照射WISTAR大鼠肺部组织进行蛋白提取、总蛋白浓度测定、蛋白质变性、凝胶电泳、转膜、免疫反应、化学发光反应、凝胶成像扫描分析、最后进行α‑1抗蛋白酶的相对表达量上调率分析；所述内照射生物损伤综合评价的具体方法是：当WISTAR大鼠肺部组织中的α‑1抗蛋白酶的相对表达量上调率在30%以内时，表明低剂量伽马射线辐照对无生物损伤效应；当WISTAR大鼠肺部组织中的α‑1抗蛋白酶的相对表达量上调率大于30%而小于100%时，此时的铀矿粉尘内照射造成的生物损伤等级为Ⅰ级；当WISTAR大鼠肺部组织中的α‑1抗蛋白酶的相对表达量上调率大于100%而小于200%时，此时的铀矿粉尘内照射造成的生物损伤等级为Ⅱ级；当WISTAR大鼠肺部组织中的α‑1抗蛋白酶的相对表达量上调率大于200%时，此时的铀矿粉尘内照射造成的生物损伤等级为Ⅲ级。...

【技术特征摘要】
1.一种利用α-1抗蛋白酶评价铀矿粉尘内照射生物损伤的方法，根据WISTAR大鼠接受气管滴注的铀矿粉尘混悬液的量与肺组织中α-1抗蛋白酶相对表达量的上调率的剂量-效应关系，通过WISTAR大鼠肺部组织中α-1抗蛋白酶的相对表达量的上调率，评估铀矿粉尘内照射造成的生物损伤，其特征在于，具体步骤是：（1）建立铀矿混悬液气管滴注WISTAR大鼠模型；（2）采集肺组织；（3）α-1抗蛋白酶相对表达量上调率的检测；（4）内照射生物损伤综合评价；所述的建立铀矿混悬液气管滴注WISTAR大鼠模型的具体方法是：选择体重在180-220g之间的WISTAR成年雄性大鼠，分4组，每组6只老鼠，对照组气管滴注生理盐水和二氧化硅的悬液，实验组分别气管滴注浓度为1.25、2.5和5.0mg/ml的铀矿粉尘悬液，每次滴注0.2ml，一周滴注3次，连续5周；所述的采集肺组织的具体方法是：用颈椎脱臼法处死大鼠，解剖后取肺组织，把各组织分成3等份，用生理盐水冲洗掉血水，除去水分，装到冻存管内，马上放入-80℃冰箱保存；所述的α-1抗蛋白酶相对表达量上调率的检测具体方法是：将收集的接受过铀矿粉尘内照射WISTAR大鼠肺部组织进行蛋白提取、总蛋白浓度测定、蛋白质变性、凝胶电泳、转膜、免疫反应、化学发光反应、凝胶成像扫描分析、最后进行α-1抗蛋白酶的相对表达量上调率分析；所述内照射生物损伤综合评价的具体方法是：当WISTAR大鼠肺部组织中的α-1抗蛋白酶的相对表达量上调率在30%以内时，表明低剂量伽马射线辐照对无生物损伤效应；当WISTAR大鼠肺部组织中的α-1抗蛋白酶的相对表达量上调率大于30%而小于100%时，此时的铀矿粉尘内照射造成的生物损伤等级为Ⅰ级；当WISTAR大鼠肺部组织中的α-1抗蛋白酶的相对表达量上调率大于100%而小于200%时，此时的铀矿粉尘内照射造成的生物损伤等级为Ⅱ级；当WISTAR大鼠肺部组织中的α-1抗蛋白酶的相对表达量上调率大于200%时，此时的铀矿粉尘内照射造成的生物损伤等级为Ⅲ级。2.根据权利要求1所述的一种利用α-1抗蛋白酶评价铀矿粉尘内照射生物损伤的方法，期特征在于，所述蛋白提取具体步骤如下：在研钵中倒入液氮预冷，迅速取出肺部组织样品，把组织切至均匀置于研钵中，马上加入液氮，进行研磨，在研钵中慢慢加入800μlLB裂解液，裂解30min，振荡1-2次，充分裂解，裂解结束后，收集1.5mL的悬液到EP管中，然后在4℃下，转速12000r/min，离心20min后，收集上清液，用树脂沉淀上清液中的蛋白，4℃，12000r/min离心20min，去掉上清，晾干，-80℃保存备用，在干燥后的蛋白质团块中加入200-250μLL3裂解液，用枪头反复吹打直至蛋白质充分分散，超声助溶，4℃，12000r/min，离心20min，吸出上清液，转移至新的EP管中。3.根据权利要求1所述的一种利用α-1抗蛋白酶评价铀矿粉尘内照射生物损伤的方法，期特征在于，所述总蛋白浓度测定的具体步骤如下：将0.2mg/ml的BSA标准品溶液加稀释液，依次稀释成0、...

【专利技术属性】
技术研发人员：丁德馨，易岚，胡南，龙鼎新，赵维超，殷杰，穆红香，李广悦，
申请(专利权)人：南华大学，
类型：发明
国别省市：湖南,43