一种基于多肽复合膜修饰电极的L-精氨酸检测方法及传感器技术

本发明专利技术公开了一种基于多肽复合膜修饰电极的L‑精氨酸（L‑Arg）检测方法及传感器，所述方法包括合成二茂铁功能化多肽二硫代环戊烷（FC‑Peptide）、制备FC‑Peptide/AuE多肽复合膜修饰电极和L‑精氨酸检测等步骤。结果表明，FC‑Peptide/AuE多肽复合膜修饰电极对L‑Arg表现出良好的电化学响应特性。在10 mmol/L磷酸盐缓冲溶液（PBS，pH=7.4）中，该多肽复合膜修饰电极的DPV响应峰电流与L‑Arg的浓度在1.000×10

A Detection Method and Sensor for L-Arginine Based on Polypeptide Composite Membrane Modified Electrode

【技术实现步骤摘要】
一种基于多肽复合膜修饰电极的L-精氨酸检测方法及传感器
本专利技术属于化学/生物传感
，具体涉及一种基于多肽复合膜修饰电极的L-精氨酸检测方法及传感器。
技术介绍
L-精氨酸(L-Arg)是一种条件必须氨基酸，是维持婴幼儿生长发育必不可少的氨基酸，在伤口愈合、细胞分裂、维持机体电荷平衡和生理功能中起着极其重要的作用。同时它是内源性一氧化氮合成的底物，是尿素循环的重要代谢产物。正常人体内精氨酸含量为90-150μmol/L，而在胰腺癌、食管癌、乳腺癌患者体内精氨酸含量分别为76±5μmol/L、41.9±13.4μmol/L、80±3μmol/L，显然低精氨酸水平指示生理异常。此外，精氨酸具有加强肠道黏膜屏障，减少细菌移位，发挥抗炎作用，所以术后加强精氨酸的摄入，可以减小术后感染的发生率、消除术后疲劳、促进机体恢复。因此，开发一种快速、灵敏检测L-Arg含量的方法，在生命科学和营养健康领域具有十分重要的意义。目前，已有多种方法被报道用于检测精氨酸，如比浊法、分光光度法、液相色谱法、毛细管电泳法、质谱分析法、表面等离子共振法、荧光分析法等，其中Ding等制备了基于二芳基-罗丹明衍生物的荧光传感器，发现其与Cu2+的复合物显示出对L-Arg的荧光传感能力，该复合物对L-Arg具有较高灵敏度与良好的选择性，检测下限为2.2μmol/L。然而，这些仪器分析的方法存在设备笨重、价格昂贵等缺点，而电化学传感器检测L-Arg具有快速、灵敏、选择性好等优点，已引起了广泛关注。其中，基于双酶(精氨酸酶I和脲酶)和电活性聚苯胺修饰的铂电极(PANi/Nafion/Pt)，可应用于葡萄酒和果汁样品中L-Arg的检测，检测下限为0.038mmol/L。随后，Stasyuk等发展了基于过度产生人肝脏精氨酸酶I重组酵母细胞的L-精氨酸生物传感器，该传感器具有响应快速(60s)和检测限低(0.085mmol/L)等优点。但是，这几种检测精氨酸的电化学传感器都需要酶的参与，使其应用受到局限。近年来，由于多肽能模拟蛋白质的多种结构和功能特征，且多肽易于合成与修饰、成本降低、易于保存、有良好的热稳定性，基于多肽的电化学传感器逐渐应用于蛋白质、抗原等生物分子的检测。Zhao等使用二茂铁(FC)功能化螺旋肽测定酶活性前列腺特异性抗原(PSA)，其电化学测量原理是基于在PSA存在下FC-肽在金电极表面上的特异性蛋白水解切割，导致电极的电流信号的改变；该电极制备简单，具有良好的选择性，检测下限为0.2ng/mL。HWang等将Noro-1肽固定在金电极表面上，该电极应用于检测人类诺如病毒，具有良好的重现性与稳定性，检测下限为99.8nmol/L。Yang等筛选出对双酚A表现出特异性的七肽，通过肽分子与Au表面之间的自组装，成功制备了一种电化学双酚A传感器，该传感器具有良好的灵敏度，检测下限为0.7nmol/L。然而但迄今为止，基于多肽用于检测L-精氨酸的无酶电化学传感器尚未见报道。
技术实现思路
本专利技术旨在克服现有技术的不足，提供一种基于多肽复合膜修饰电极的L-精氨酸检测方法及传感器。为了达到上述目的，本专利技术提供的技术方案为：所述基于多肽复合膜修饰电极的L-精氨酸检测方法包括如下步骤：(1)合成二茂铁功能化多肽二硫代环戊烷(FC-Peptide)；所述二茂铁功能化多肽二硫代环戊烷结构式如式(I)所示：(2)制备FC-Peptide/AuE多肽复合膜修饰电极：将金电极于Piranha溶液中浸泡后清洗，然后抛光，洗净并用N2吹干；将吹干后的金电极浸入二茂铁功能化多肽二硫代环戊烷浓度为30～80μmol/L的二茂铁功能化多肽二硫代环戊烷溶液和三(2-羧乙基)膦浓度为10～80μmol/L的磷酸盐缓冲溶液(PBS，10mmol/L，pH＝7.4)中20～30h；再将金电极于6-巯基-1-己醇浓度为0.5～2.0mmol/L的6-巯基-1-己醇溶液中浸泡2～30min后，用PBS沿着金电极表面冲洗以除去非特异性吸附的其它物质，用N2吹干即得FC-Peptide/AuE多肽复合膜修饰电极；(3)以FC-Peptide/AuE多肽复合膜修饰电极为工作电极，以银/氯化银电极作为参比电极，以铂丝电极作为对电极，构成三电极体系；然后采用循环伏安法和示差脉冲伏安法考察不同修饰电极的电化学行为，并采用示差脉冲伏安法对不同浓度的L-精氨酸进行测试，绘制工作标准曲线，再采用标准加入法对待测样品中的L-精氨酸进行检测。优选地，步骤(2)中对金电极表面进行抛光是分别用1.0μm、0.3μm和0.05μm的氧化铝粉对金电极表面进行抛光。优选地，步骤(2)中所述金电极直径为3mm。优选地，步骤(3)中是在10mmol/L磷酸盐缓冲溶液(PBS，pH＝7.4)、2.0mmol/L[Fe(CN)6]4-/3--0.20mol/LNa2SO4溶液、含有1.0×10-5mol/L精氨酸的PBS(10mmol/L，pH＝7.4)溶液中采用循环伏安法和示差脉冲伏安法考察不同修饰电极的电化学行为，采用示差脉冲伏安法对不同浓度的L-精氨酸进行电流响应与浓度关系测试；示差脉冲伏安法参数为：振幅0.05V，脉冲周期0.5s，抽样宽度0.02，脉冲宽度0.2s，循环伏安法参数为：采样间隔0.001V，扫速100mV/s。基于多肽复合膜修饰电极的L-精氨酸检测传感器包括作为工作电极的多肽复合膜修饰电极；所述多肽复合膜修饰电极包括金基质(5)，所述金基质(5)表面修饰有多肽复合膜层(6)，所述多肽复合膜层(6)中含有多肽分子(7)。优选地，所述多肽分子(7)为二茂铁功能化多肽二硫代环戊烷分子，所述二茂铁功能化多肽二硫代环戊烷分子的氨基酸序列为GGGGFGHIHEGYGGGGK(SEQIDNO.2)，两端的-GGGG-和-GGGGK-为连接序列(Linker)。优选地，所述多肽复合膜层(6)中还含有6-巯基-1-己醇分子(8)。优选地，所述金基质(5)的厚度为1.0～5.0mm，所述多肽复合膜层(6)的厚度为2～20nm。优选地，所述传感器对L-精氨酸的浓度存在良好的线性关系，检测的线性范围为1.000×10-14～1.000×10-5mol/L，检出限为1.000×10-14mol/L。本专利技术首先筛选出了L-精氨酸(L-Arg)特异性肽序列FGHIHEGY(SEQIDNO.1)，基于此序列，以两端的-GGGG-和-GGGGK-为连接序列(Linker)，合成了两端分别具有二茂铁与1,2-二硫代环戊烷-3-正丁基残基侧链的二茂铁功能化多肽，即，二茂铁功能化十七肽二硫代环戊烷(FC-P17Peptide)，其中含有碳链骨架桥—(CH2)4—，其氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。该肽末端具有二硫基，还原剂三(2-羧乙基)膦(简称：TCEP)的加入打断了二硫键而形成两个硫醇基团，硫醇基团能在金电极表面通过Au-S键结合，从而避免使用任何连接剂。本专利技术通过将二茂铁功能化多肽修饰到金电极的表面上，并以6-巯基-1-己醇(简称：MCH)为封闭剂，制得新型的多肽复合膜修饰电极，即FC-P17Peptide/AuE。通过循环伏安法(CV)与示差脉冲伏安法(DPV)证实在电极表面形成了L-Arg特异性肽分子的自组本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于多肽复合膜修饰电极的L‑精氨酸检测方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：(1)合成二茂铁功能化多肽二硫代环戊烷；所述二茂铁功能化多肽二硫代环戊烷结构式如式(I)所示：

【技术特征摘要】
1.一种基于多肽复合膜修饰电极的L-精氨酸检测方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：(1)合成二茂铁功能化多肽二硫代环戊烷；所述二茂铁功能化多肽二硫代环戊烷结构式如式(I)所示：(2)制备FC-Peptide/AuE多肽复合膜修饰电极：将金电极于Piranha溶液中浸泡后清洗，然后抛光，洗净并用N2吹干；将吹干后的金电极浸入二茂铁功能化多肽二硫代环戊烷浓度为30～80μmol/L的二茂铁功能化多肽二硫代环戊烷溶液和三(2-羧乙基)膦浓度为10～80μmol/L的磷酸盐缓冲溶液中20～30h；再将金电极于6-巯基-1-己醇浓度为0.5～2.0mmol/L的6-巯基-1-己醇溶液中浸泡2～30min后，用PBS沿着金电极表面冲洗以除去非特异性吸附的其它物质，用N2吹干即得FC-Peptide/AuE多肽复合膜修饰电极；(3)以FC-Peptide/AuE多肽复合膜修饰电极为工作电极，以银/氯化银电极作为参比电极，以铂丝电极作为对电极，构成三电极体系；然后采用循环伏安法和示差脉冲伏安法考察不同修饰电极的电化学行为，并采用示差脉冲伏安法对不同浓度的L-精氨酸进行测试，绘制工作标准曲线，再采用标准加入法对待测样品中的L-精氨酸进行检测。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中对金电极表面进行抛光是分别用1.0μm、0.3μm和0.05μm的氧化铝粉对金电极表面进行抛光。3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中所述金电极直径为3mm。4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中是在10mmol/L磷酸...

【专利技术属性】
技术研发人员：曹忠，周立，朱凯杰，朱钦，何婧琳，肖忠良，贺玉敏，冯泽猛，印遇龙，
申请(专利权)人：长沙理工大学，
类型：发明
国别省市：湖南,43