本发明专利技术公开了一种制备纳米酶探针的方法，由该方法制得的纳米酶探针作为信号输出手段，提高了生物传感的灵敏度，同时也极大的提高了生物传感的速度从而使得生物传感的信号顺利输出；基于纳米酶探针构建了一种电化学传感检测方法，该方法具有极低的检测限，能检测低至fg级的微量BNP，体现了高度的特异性和灵敏性，适合临床与科学研究；基于纳米酶探针构建了一种比色化学传感的检测方法，具有极快的传感时间和便捷操作，快速简单的检测BNP，适合家庭使用。
Brain Natriuretic Peptide Colorimetric/Electrochemical Sensing Detection Based on Nano-Enzyme Detection
【技术实现步骤摘要】
一种基于纳米酶探的脑利钠肽比色/电化学传感检测法
本专利技术涉及纳米酶探针及基于其的脑利钠肽比色/电化学传感的检测方法。
技术介绍
由脑和心室心肌细胞分泌的脑利钠肽(BNP)是含有32个氨基酸的肽。BNP在体液平衡中起关键作用。最近的研究表明，BNP升高对心力衰竭，各种呼吸系统疾病的鉴别诊断和急性心肌梗死的评估具有重要意义。BNP的定量测量和实时跟踪对于疾病的治疗和患者的康复具有重要意义。心力衰竭的发生主要是因为心脏无法通过心肌缺陷将血液泵送到每个身体部位。由于心力衰竭表现出各种症状，医生面临着诊断和预后的挑战。到目前为止，临床上针对BNP的检测主要是抽血化验，使用大型的分析仪器或者简便的试剂盒。这些方法存在着诸多的限制。譬如大型的分析仪器成本高昂，操作复杂，检测时间慢。而简便的试剂盒检测方法又存在检测精度不足，检测限高，且难以区分较低浓度的BNP，保质期短的问题。同时BNP半衰期短的，这为定量测量和实时跟踪带来困扰。近年来，免疫色谱和实时PCR的方法的兴起，也并没有很好地解决高成本和耗时的缺点。酶标记的方法通常被用于生物传感器，提供信号放大的效率，常见的有辣根过氧化物酶(HRP)和碱性磷酸酶(ALP)。然而应用天然酶可在电极表面上产生不导电的不溶性产物，并且不溶沉淀可以阻止氧化还原探针的电子转移过程。此外，这些酶在电极界面上的组装由于其有限的稳定性而成为瓶颈。人工模拟酶被用作催化放大器已成为研究趋势。类似于天然酶，模拟酶具有对特定基质的高催化活性，而它们更多比天然酶稳定，不会阻碍信号传递的诸多优点。血红素是大部分催化氧化酶的活性中心，因此受到广泛关注。很多研究者利用它和DNA构建HRP的模拟酶，在过氧化氢存在的条件下，催化底物氧化。但是固定的血红素存在着不稳定和高成本的风险。磁性纳米颗粒(MNPs)由于其近年来巨大的生物技术应用而变得具有吸引力。它们的生物相容性和超顺磁性使它们适用于多种生物应用，磁性纳米粒子作为一种良好的磁性生物载体，具有一些吸引人的特性，如比表面积大，可以增加负载生物分子的数量，通过外部磁铁简单分离，避免非特异性吸附，促进抗原与抗体之间的反应，简单易行小型化。因此，本领域的技术人员致力于开发一种灵敏度高、特异性强并且简单的基于纳米酶探针的脑利钠肽比色/电化学传感的检测方法。
技术实现思路
有鉴于现有技术的上述缺陷，本专利技术所要解决的技术问题是如何灵敏度高、特异性强并且简单的基于纳米酶探针的脑利钠肽比色/电化学传感的检测方法。为实现上述目的，本专利技术提供了一种纳米酶探针，包括Hemin-AuNPs纳米酶和靶标蛋白，靶标蛋白与Hemin-AuNPs纳米酶通过静电吸附偶联，Hemin-AuNPs纳米酶含有Hemin和AuNPs，Hemin和AuNPs通过共价键连接。进一步的，靶标蛋白为脑利钠肽。本专利技术提供了一种制备如权利要求1的纳米酶探针的方法，包括如下步骤：(1)、将PADS溶液加入到沸腾的HAuCl4水溶液中形成混合溶液，按照质量比，PADS溶液∶HAuCl4溶液为3.0～5.0∶1.0～2.0，HAuCl4水溶液中HAuCl4的质量分数为1％；(2)、将混合溶液冷却回流5～20分钟后，冷却至室温，获得氨基表面修饰的AuNPs为N-AuNPs；(3)、将250～350μL的Hemin溶液(pH＝10～13)、50～150μL吐温溶液(1％)、10～25mgEDC和0.2～1mgSH-PEG加入到10～15mLN-AuNPs溶液中，在黑暗中孵育1～5小时后，将反应溶液离心10～30分钟，并将所得沉淀物洗涤以除去上清液中未结合的Hemin，然后将Hemin-AuNPs重悬于超纯水中，得到Hemin-AuNPs溶液；(4)、将Hemin-AuNPs溶液和靶标蛋白溶液按照体积比9∶1混合，置于30～45℃下孵育5～8小时，使靶标蛋白与Hemin-AuNPs通过静电吸附作用偶联，反应完成后离心10～30分钟，并将所得沉淀物洗涤以除去上清液中未结合的靶标蛋白，然后将靶标蛋白-Hemin-AuNPs重悬于超纯水中，以获得靶标蛋白-Hemin-AuNPs的纳米酶探针。进一步的，步骤(1)中按照质量比，PADS溶液∶HAuCl4溶液为5.0∶1.0，PADS溶液的浓度为14mg·mL-1，步骤(3)中Hemin溶液浓度为1mM，pH＝11，步骤(4)中靶标蛋白为脑利钠肽。本专利技术还提供了一种基于纳米酶探针的脑利钠肽比色传感的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：(a)制备脑利钠肽抗体功能化修饰的MNPs溶液在超声波处理下将0.22MEDC溶液、0.22MNHS溶液与10mg/mLMNPs溶液混合15～30分钟，磁分离后，去除第一上清液，使用2～3mL超纯水洗涤后重悬MNPs为MNPs溶液，将100～300uL的0.4mM脑利钠肽抗体溶液加入到MNPs溶液中，连续搅拌60～150分钟，磁分离后，去除第二上清液，使用超纯水洗涤沉淀后重悬MNPs为溶液，获得BNP抗体功能化修饰的MNPs溶液；(b)在待测溶液中，加入如权利要求1的的纳米酶探针溶液和步骤(a)中制备的脑利钠肽抗体功能化修饰的MNPs溶液形成混合物，将混合物在37℃反应20～40分钟，经过磁分离，取出混合物的上清液待测；(c)向上清液中加入过氧化氢溶液和ABTS溶液，在30～42℃下充分反应，待反应完全后使用UV-vis检测。进一步的，步骤(a)中0.22MEDC溶液、0.22MNHS溶液与10mg/mLMNPs溶液是按照体积比1∶1∶1进行混合。进一步的，步骤(b)中按照体积比，待测溶液∶纳米酶探针溶液∶脑利钠肽抗体功能化修饰的MNPs溶液为10∶1∶1，步骤(c)中按照体积比，上清液∶过氧化氢溶液∶ABTS溶液为8∶1∶1。本专利技术还提供了一种基于纳米酶探针的脑利钠肽电化学传感的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：(i)制备脑利钠肽抗体功能化修饰的MNPs溶液在超声波处理下将0.22MEDC溶液、0.22MNHS溶液与10mg/mLMNPs溶液混合15～30分钟，磁分离后，去除第一上清液，使用超纯水洗涤后重悬MNPs为MNPs溶液，将0.4mM脑利钠肽抗体溶液加入到MNPs溶液中，连续搅拌60～150分钟，磁分离后，去除第二上清液，使用超纯水洗涤沉淀后重悬MNPs为溶液，获得脑利钠肽抗体功能化修饰的MNPs溶液；(ii)制备裸磁性金电极首先使用0.3μm和0.05μm直径的氧化铝颗粒分别在白色尼龙布和咖啡色绒布在上打磨电极以产生类似镜面的光洁度，然后通过在超纯水和乙醇中分别超声处理电极各五分钟，除去剩余的氧化铝粉末，接下来使用piranha溶液(98％H2SO4∶30％H2O2＝3∶1(v/v))浸泡金电极2～10分钟，彻底除去原先的电极表面修饰材料，再用超纯水冲洗电极，最后，在0.5M的H2SO4溶液中进行循环伏安法扫描0V到1.6V电位区间，清洁并活化电极以除去其它残留的杂质，完成后用氮气吹扫电极使其干燥后备用，得到裸磁性金电极；(iii)取待测溶液，加入脑利钠肽抗体功能化修饰的MNPs溶液和如权利要求1的纳米酶探针的溶液形成混合物溶液，将裸磁性金电极浸没在混合物溶液中，在37℃反应15～40分钟；(iv)取出反应后的磁性电极，使用电化学本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种制备纳米酶探针的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)将PADS溶液加入到HAuCl4水溶液中形成混合溶液，按照质量比，PADS溶液∶HAuCl4溶液为3.0～5.0∶1.0～2.0，HAuCl4水溶液中HAuCl4的质量分数为1％；(2)将所述混合溶液冷却回流5～20分钟后，冷却至室温，获得氨基表面修饰的AuNPs为N‑AuNPs；(3)将250～350μL pH＝10～13的Hemin溶液、50～150μL吐温溶液、10～25mg EDC和0.2～1mg SH‑PEG加入到10～15mL N‑AuNPs溶液中，闭光孵育1～5小时后，将反应溶液离心10～30分钟，然后将颗粒物Hemin‑AuNPs重悬于超纯水中，得到Hemin‑AuNPs溶液；(4)将所述Hemin‑AuNPs溶液和靶标蛋白溶液按照体积比9∶1混合，置于30～45℃下孵育5～8小时，反应完成后离心10～30分钟，然后将获得物靶标蛋白‑Hemin‑AuNPs重悬于超纯水中，以获得靶标蛋白‑Hemin‑AuNPs的纳米酶探针的溶液。
【技术特征摘要】
1.一种制备纳米酶探针的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)将PADS溶液加入到HAuCl4水溶液中形成混合溶液，按照质量比，PADS溶液∶HAuCl4溶液为3.0～5.0∶1.0～2.0，HAuCl4水溶液中HAuCl4的质量分数为1％；(2)将所述混合溶液冷却回流5～20分钟后，冷却至室温，获得氨基表面修饰的AuNPs为N-AuNPs；(3)将250～350μLpH＝10～13的Hemin溶液、50～150μL吐温溶液、10～25mgEDC和0.2～1mgSH-PEG加入到10～15mLN-AuNPs溶液中，闭光孵育1～5小时后，将反应溶液离心10～30分钟，然后将颗粒物Hemin-AuNPs重悬于超纯水中，得到Hemin-AuNPs溶液；(4)将所述Hemin-AuNPs溶液和靶标蛋白溶液按照体积比9∶1混合，置于30～45℃下孵育5～8小时，反应完成后离心10～30分钟，然后将获得物靶标蛋白-Hemin-AuNPs重悬于超纯水中，以获得靶标蛋白-Hemin-AuNPs的纳米酶探针的溶液。2.如权利要求1所述的制备纳米酶探针的方法，其中，步骤(1)中按照质量比，PADS溶液∶HAuCl4溶液为5.0∶1.0，所述PADS溶液的浓度为14mg·mL-1，步骤(3)中Hemin溶液浓度为1mM，pH＝11，步骤(4)中靶标蛋白为脑利钠肽。3.一种基于纳米酶探针的脑利钠肽比色传感的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：(a)在待测溶液中，加入如权利要求1的所述的纳米酶探针的溶液和脑利钠肽抗体功能化修饰的MNPs溶液形成混合物，将所述混合物在37℃反应20～40分钟，经过磁分离，取出所述混合物的上清液待测；(b)向所述上清液中加入过氧化氢溶液和ABTS溶液，在30～42℃下充分反应，待反应完全后使用UV-vis检测。4.如权利要求3所述的脑利钠肽比色传感的检测方法，其中，制备脑利钠肽抗体功能化修饰的MNPs的方法为在超声波处理下将0.22MEDC溶液、0.22MNHS溶液与10mg/mLMNPs溶液混合15～30分钟，磁分离后，去除第一上清液，使用超纯水洗涤后重悬MNPs为...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈红霞，
申请(专利权)人：上海大学，
类型：发明
国别省市：上海,31
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