淡水鱼中隐性孔雀石绿的快速提取和检测方法技术

本发明专利技术涉及隐性孔雀石绿的检测方法，具体涉及，淡水鱼中隐性孔雀石绿的快速提取和检测方法，首先，快提淡水鱼中孔雀石绿和隐性孔雀石绿，加入硼氢化钾粉末将孔雀石绿转化成隐性孔雀石绿，色谱‑光谱联用采集其多波长色谱数据，经处理得到不含隐性孔雀石绿的本底光谱数据库N，第二，建立隐性孔雀石绿的标准光谱数据库V，第三，快速提取市售淡水鱼样本，加入硼氢化钾粉末后采集样品紫外‑可见光谱c，第四，采用向量‑子空间夹角判据算法快速计算待测样品中隐性孔雀石绿总量。本发明专利技术解决了现有孔雀石绿和隐性孔雀石绿提取方法繁琐，操作复杂，提取率低的问题，实现了淡水鱼中隐性孔雀石绿快速检测。

Rapid Extraction and Detection of Recessive Malachite Green from Freshwater Fish

【技术实现步骤摘要】
淡水鱼中隐性孔雀石绿的快速提取和检测方法
本专利技术涉及隐性孔雀石绿的检测方法，具体涉及淡水鱼中隐性孔雀石绿的快速提取和检测方法。
技术介绍
孔雀石绿(malachitegreen，简写MG)属于三苯基甲烷型的染料，是有毒的三苯基甲烷类化学物质，常被用在预防和治疗鱼类的水霉病、鳃霉病、小瓜虫病等以及鱼类保鲜。MG进入人或动物体内后，可通过生物转化产生隐色孔雀绿(LeucomalachiteGreen，简写LMG)，LMG对光敏感，在260nm处具有最强的吸收峰，具有致癌性，致畸性和致突变性等副作用。我国《NY5071-2002无公害食品鱼药使用准则》已将MG列入禁用药物。MG在鱼体内会转化为LMG且停留的时间很长，由于其含量极其少，以至于难检测到其存在。现阶段，我国用于检测含有MG和LMG水产品的国家标准及相关文献方法主要有以下几种：高效液相色谱法、荧光法、拉曼光谱法、酶联免疫法、液-质联用法等。高效液相色谱法：现有国家标准及文献对水产品中的MG及LMG的提取方法，均同时或部分添加二甘醇、盐酸羟胺、对-甲苯磺酸及乙酸铵缓冲溶液进行提取，加入KBH4溶液还原测定LMG或加入过氧化铅氧化测定MG，采用二氯甲烷进行液液萃取，并使用中性氧化铝、PRS等固相萃取柱洗脱净化。国标回收率为70-110％，检出限为0.5μg/kg；相关文献改进国标方法后回收率在82％以上，准确度高。荧光法：MG对水溶性CdTe/ZnS量子点会发生荧光猝灭现象，依据这一性质建立检测水产的方法，在pH＝8，0.065mol/L的Tris-HCl缓冲溶液和1.60×10-4mol/L的CdTe/ZnS量子点优化体系，MG质量在0.0193-1.28mg/L和CdTe/ZnS量子点的荧光猝灭强度呈线性关系。检出限为0.00543mg/L，回收率为90.4-100.3％，RSD值为0.37-1.01％，准确度较高。拉曼光谱法：利用MG位于432-437cm-1、1166-1170cm-1和1613-1617cm-1的拉曼光谱的特征峰和强度，测定水产养殖水中的MG，检出限为5mg/L，精密度RSD值为0.51％，方法重现性好、耗时少。酶联免疫法：应用其中一种酶联免疫试剂盒对市场中不同的水产品进行抽检其残留的MG和LMG的含量，检出率为6.98％，可以用来快速筛查大量水产品。液相-质谱联用法：氘代LMG被用作内标。加入盐酸羟胺、对甲苯磺酸、乙酸铵，混合均匀后，用乙腈提取样品，通过离心和中性氧化铝纯化，再加入二氯甲烷进行萃取，然后用氮气吹至接近干燥，初始流动相恒定后，将其在C18柱上分离和MRM模式检测，回收率为86.5—91.8％，检出限为0.1μg/L，RSD小于7％，结果具有一定的准确性。色谱方法灵敏度高，但其时间和溶剂消耗高，分光光度法在国内运用比较广泛，但其存在灵敏度不够高的缺点，对低浓度检测有一定的影响。酶联免疫分析需要消除蛋白质干扰，预处理过程复杂。在现行国家、地方标准以及大部分文献中，主要以MG的分析检测为研究对象，对LMG的检测报道较少。对MG和LMG快速检测技术有拉曼光谱法和酶联免疫法，但是拉曼光谱法的灵敏度较差，酶联免疫法检测成本较高，存在假阴性和假阳性的情况。
技术实现思路
本专利技术的目的是克服上述缺陷，提供淡水鱼中隐性孔雀石绿的快速提取和检测方法，以隐性孔雀石绿总量计。近年来，快速分析技术是食品安全检测的发展趋势，本专利技术基于向量-子空间夹角判据法建立了淡水鱼中LMG的快速提取和检测方法。本专利技术的技术方案：淡水鱼中隐性孔雀石绿的快速提取和检测方法，包括：步骤1，将淡水鱼放在含有孔雀石绿的水中培养24h，可食部分去除鱼鳞、鱼皮和骨头，鱼肉中加入乙腈，快速提取，得到含有隐性孔雀石绿和孔雀石绿的样品，加入硼氢化钾粉末将孔雀石绿转化成隐性孔雀石绿；将液相色谱-光谱仪联用，采集完全分离后的多波长色谱数据阵列，扣除待测组分隐性孔雀石绿的色谱数据，得到数据量大的本底数据库B，对B进行主成分分析和奇异值分解降低维度，得到数据量小的本底数据库N；步骤2，建立隐性孔雀石绿标准品数据库V，用分析天平称取隐性孔雀石绿标准品，采用乙腈溶解标准品固体，配成标准储备液，再将标准储备液分别稀释成不同浓度的标准品，采集全波长下的紫外-可见光谱数据，经最小二乘回归法得到多波长标准隐性孔雀石绿紫外-可见光谱数据库V；步骤3，取市售鱼肉的可食部分，加入乙腈快速提取得到样品，在样品提取液中加入硼氢化钾粉末，将孔雀石绿完全转化成隐性孔雀石绿，采集待测鱼肉样品全波长下的紫外-可见光谱数据，得到待测鱼肉样品光谱数据库c；步骤4，采用向量-子空间夹角判据方法计算样品的隐性孔雀石绿总含量。进一步的，所述本底数据库N的样品为不同品种的多个鱼肉样品，对应的本底数据库N为不同品种的多个鱼肉样品的光谱数据库的集合。进一步的，所述向量-子空间夹角判据方法包括：(1)根据定量精度设定扣减步数Δ；(2)在算式yi＝aix+bi中带入较大的x1值，得到v1，yi表示i波长下隐性孔雀石绿的吸光度值，ai、bi指代常数，x表示隐性孔雀石绿的浓度，v1即为浓度为x1下隐性孔雀石绿的多波长吸光度y1，v1是所有yi的值所组成的矩阵；(3)从待测鱼肉样品光谱数据库c中扣除v1/Δ，扣除后的变量记为dc；将本底数据库N和变量dc合并，记为对照空间R，计算对照空间R与v1的夹角；(4)从待测鱼肉样品光谱数据库c中一步一步扣除v1，重复步骤(3)，计算R与v1夹角值；(5)重复步骤(4)，当待测鱼肉样品光谱数据库c中隐性孔雀石绿完全被扣除后，对照空间R和v1的空间夹角会出现最大值θmax，记录θmax出现时所对应的扣减步数λmax，通过隐性孔雀石绿的浓度x1和扣减步数λmax，计算待测鱼肉样品中隐性孔雀石绿的含量y1；计算方法为y1＝x1×λmax/Δ，得到的y1值即为待测鱼肉样品中隐性孔雀石绿的含量；若空间夹角所对应的扣减步数为1，或者空间夹角值随扣减步数单调递增或递减，则样品中不含待测组分隐性孔雀石绿。进一步的，所述液相色谱-光谱仪联用中的高效液相色谱的流动相为乙腈:乙酸-乙酸铵缓冲溶液，乙腈:乙酸-乙酸铵体积比为70-80:20-30，pH为4.6。进一步的，所述检测方法的隐性孔雀石绿检出限为100μg/kg，0.01μg/mL。进一步的，所述快速提取，具体是样品加乙腈后在10000r/min匀浆机中匀浆，加酸性氧化铝(200-300目)净化，然后用快速混匀器振荡，在4000r/min高速离心机离心5min，上清液过0.45um微孔滤膜。进一步的，步骤1和步骤3中，1mL10.0μg/mL的孔雀石绿可以完全转化成6.5μg/mL隐性孔雀石绿，孔雀石绿的转化当量为0.65，加入过量的硼氢化钾不影响隐性孔雀石绿的含量。进一步的，步骤1和步骤3中，加入硼氢化钾粉末将孔雀石绿转化成隐性孔雀石绿后，样品应进行高速离心，取上清液进行检测。本专利技术优点：1、本专利技术首次提出了基于向量-子空间夹角判据对鱼肉中LMG的快速检测，用硼氢化钾粉末将MG完全转化为LMG后测定LMG总含量，转化率优于过氧化铅将LMG转化为MG。解决了大量使用溶剂、耗时长的高效液相色谱的问题，对快速检测和现场检测有很大的帮助。2、本专利技术样品处理本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.淡水鱼中隐性孔雀石绿的快速提取和检测方法，其特征在于，包括：步骤1，将淡水鱼放在含有孔雀石绿的水中培养24h，可食部分去除鱼鳞、鱼皮和骨头，鱼肉中加入乙腈，快速提取，得到含有隐性孔雀石绿和孔雀石绿的样品，加入硼氢化钾粉末将孔雀石绿转化成隐性孔雀石绿；将液相色谱‑光谱仪联用，采集完全分离后的多波长色谱数据阵列，扣除待测组分隐性孔雀石绿的色谱数据，得到数据量大的本底数据库B，对B进行主成分分析和奇异值分解降低维度，得到数据量小的本底数据库N；步骤2，建立隐性孔雀石绿标准品数据库V，用分析天平称取隐性孔雀石绿标准品，乙腈溶解，配成标准储备液，再将标准储备液分别稀释成不同浓度的标准品，采集全波长下的紫外‑可见光谱数据，经最小二乘回归法得到多波长标准隐性孔雀石绿紫外‑可见光谱数据库V；步骤3，取市售鱼肉的可食部分，加入乙腈快速提取得到样品，在样品提取液中加入硼氢化钾粉末，将孔雀石绿完全转化成隐性孔雀石绿，采集待测鱼肉样品全波长下的紫外‑可见光谱数据，得到待测鱼肉样品光谱数据库c；步骤4，采用向量‑子空间夹角判据方法计算样品的隐性孔雀石绿总含量。

【技术特征摘要】
1.淡水鱼中隐性孔雀石绿的快速提取和检测方法，其特征在于，包括：步骤1，将淡水鱼放在含有孔雀石绿的水中培养24h，可食部分去除鱼鳞、鱼皮和骨头，鱼肉中加入乙腈，快速提取，得到含有隐性孔雀石绿和孔雀石绿的样品，加入硼氢化钾粉末将孔雀石绿转化成隐性孔雀石绿；将液相色谱-光谱仪联用，采集完全分离后的多波长色谱数据阵列，扣除待测组分隐性孔雀石绿的色谱数据，得到数据量大的本底数据库B，对B进行主成分分析和奇异值分解降低维度，得到数据量小的本底数据库N；步骤2，建立隐性孔雀石绿标准品数据库V，用分析天平称取隐性孔雀石绿标准品，乙腈溶解，配成标准储备液，再将标准储备液分别稀释成不同浓度的标准品，采集全波长下的紫外-可见光谱数据，经最小二乘回归法得到多波长标准隐性孔雀石绿紫外-可见光谱数据库V；步骤3，取市售鱼肉的可食部分，加入乙腈快速提取得到样品，在样品提取液中加入硼氢化钾粉末，将孔雀石绿完全转化成隐性孔雀石绿，采集待测鱼肉样品全波长下的紫外-可见光谱数据，得到待测鱼肉样品光谱数据库c；步骤4，采用向量-子空间夹角判据方法计算样品的隐性孔雀石绿总含量。2.根据权利要求1所述的快速提取和检测方法，其特征在于：所述本底数据库N的样品为不同品种的多个鱼肉样品，对应的本底数据库N为不同品种的多个鱼肉样品的光谱数据库的集合。3.根据权利要求1所述的快速提取和检测方法，其特征在于，所述向量-子空间夹角判据方法包括：(1)根据定量精度设定扣减步数Δ；(2)在算式yi＝aix+bi中带入较大的x1值，得到v1，yi表示i波长下隐性孔雀石绿的吸光度值，ai、bi指代常数，x表示隐性孔雀石绿的浓度，v1即为浓度为x1下隐性孔雀石绿的多波长吸光度y1，v1是所有yi的值所组成的矩阵；(3)从待测鱼肉样品光谱数据库c中扣除v1/Δ，扣除后的变量记为dc；将本底数据库N和...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘柳，韦媛媛，徐传杰，忻欣，林华，韩莹，粟晖，董华秀，
申请(专利权)人：广西科技大学，广西壮族自治区计量检测研究院，
类型：发明
国别省市：广西,45