一种基于多步固定修饰的酶电极及其制备方法和应用技术

本发明专利技术提供了一种基于多步固定修饰的酶电极及其制备方法和应用。该酶电极制备方法为：将β‑环糊精溶解于戊二醛的水溶液中，得到溶液A；加入二茂铁和/或二茂铁衍生物混合溶解，得到溶液B；与Nafion溶液混合至沉淀消失后得到透明的溶液C；加入牛血清白蛋白、葡萄糖氧化酶和戊二醛进行充分交联反应，得到溶液D；将溶液D修饰到基底电极的工作电极区域的表面，得到初步修饰的酶电极；将有机高分子聚合物溶液修饰到酶电极工作电极区域的表面，烘干后得到。该酶电极具有很好的稳定性，对葡萄糖具有很好的响应；将其发展成为一种低成本、稳定的持续动态葡萄糖检测的分析方法，对于血糖持续监测和糖尿病的动态分析管理具有重要的意义。

An Enzyme Electrode Based on Multi-step Immobilization Modification and Its Preparation and Application

【技术实现步骤摘要】
一种基于多步固定修饰的酶电极及其制备方法和应用
本专利技术属于酶电极
，涉及一种基于多步固定修饰的酶电极及其制备方法和应用。
技术介绍
血糖监测是糖尿病管理中的重要组成部分，其结果有助于评估糖尿病患者糖代谢紊乱程度，制定合理的降糖方案，防止并减少并发症的产生。传统血糖监测采用血糖试条对末梢血糖的浓度进行检测，即指血测糖。但是，它一次只能给出一个时间点的血糖数值(即瞬间血糖)，存在着一定的片面性，并且由于瞬间血糖值容易受运动、饮食、药物、情绪波动等诸多因素影响，采用该方法无法反映出患者全面的“血糖谱”，也很难发现无症状的高血糖和低血糖。而同时获得多个血糖数据就得忍受频繁针刺的疼痛感，为患者带来了很差的体验。连续动态的血糖监测系统(ContinuesGlucoseMonitoringSystem,CGMS)通过在患者皮下组织植入或者佩戴长时间的葡萄糖传感器，来实现24小时不间断地测定人体葡萄糖浓度变化。该系统平均每几分钟记录一个葡萄糖数值，连续提供患者每日血糖图波动趋势，同时能够减轻患者频繁指血测糖的痛苦。它还可以捕捉到末梢血糖无法发现的不知觉低血糖、餐后血糖的峰值、高低血糖持续时间等相关信息，更加有利于患者了解自身血糖变化状况，也能够为临床医师选择药物、判断疗效、制订合理的饮食结构提供最科学的依据，进而达到既严格控制血糖又可避免血糖大幅度波动目的，使病人的血糖控制接近正常生理水平，从而有效防止或延缓并发症发生。目前主流的植入式动态血糖检测方法采用氧气依赖的葡萄糖氧化酶电极对皮下的葡萄糖进行连续监测，给出的血糖动态变化值。但是，由于皮下组织葡萄糖浓度较高，而氧气浓度又相对较低(一般低于30μM)，因此采用氧气作为天然电子传递剂的酶电极反应受制于皮下组织的氧气浓度影响，需要严格抑制葡萄糖在电极上的扩散速度，才能得到较好的电极检测范围。而且该类型电极也易受皮下氧气浓度波动的影响，引起葡萄糖浓度的读数误差。除此之外，氧气依赖酶电极反应生成的底物是过氧化氢，而过氧化氢具有较大的生物毒性，因此，基于氧气依赖的植入式葡萄糖氧化酶电极并不是动态血糖监测的理想选择。基于葡萄糖脱氢酶的电极虽然不受氧气浓度变化的影响，但是由于其受到体内外的常见的干扰物质影响过大，酶催化效率低且特异性不高，也不适用于植入式的动态葡萄糖的监测。因此，依赖人工加入电子传递剂的氧化酶电极应用于皮下低氧环境下持续的葡萄糖监测受到了强烈的关注。人工加入的电子传递剂能够代替氧气接受酶催化反应过程中的电子，增加电子传递速率，提高电极反应效率。而且基于电子传递剂的酶电极反应过程中并不会产生过氧化氢，降低了电极可能产生的生物毒性。一般常用的电子传递剂包括有机金属氧化还原物质如二茂铁及其衍生物、具有醌式结构的罗蓝或者靛酚、无机氧化还原物质如铁氰化物或者钌的氧化物等，而一些具有氧化还原性质的高分子聚合物也可作为酶电极反应过程中的电子传递剂。二茂铁及其衍生物因其具有良好的电子结构及氧化还原性质是一种常用的酶电极的电子传递剂。二茂铁属于有机小分子不易容易水，目前主要采用分步修饰的方法将溶于有机溶剂的二茂铁首先修饰到电极上然后再进一步修饰酶层，但是这样会阻碍二茂铁与酶之间的电子传递，大大降低了酶电极的反应效率，且二茂铁小分子没有进行固定，非常容易从电极层上流失。一些研究利用一些高分子膜物质形成网状结构来承载二茂铁小分子，虽然能一定程度提高二茂铁在电极上的稳定性，但二茂铁分子较小，依旧容易流失。而一些研究则通过类似主客体的方法将二茂铁溶于环糊精的有机官能团的中心，而利用环糊精良好的水溶性将该二茂铁与酶进行复合，而环糊精聚合物能够以稳定的状态存在电极表面。然而，事实上，在酶电极反应过程中，二茂铁失去电子后被氧化后的产物处于阳离子带正电荷的状态，极性发生了巨大变化，其与环糊精的结合能力则大大降低，若将其用于长时间的酶电极催化反应，依然存在二茂铁流失的问题。而采用带负电的高分子聚合物或者是纳米粒子仅仅能够有效吸附二茂铁阳离子氧化产物不会流失，但是又无法阻止零价态的二茂铁的流失。总之，现有的方法大部分只是对单一状态的二茂铁或者二茂铁阳离子进行固定，无法对酶电极反应中两种形态的二茂铁进行固定，二茂铁的流失不仅会造成基于该电子传递剂的酶电极及其他相关电极检测性能的下降，同时流失的二茂铁也可能对生物体产生毒性，这是限制二茂铁电子传递剂应用于酶电极检测的主要瓶颈问题。
技术实现思路
针对现有技术中固定修饰二茂铁电子传递剂方法存在的技术缺陷，本专利技术得目的在于提供一种基于多步固定修饰的酶电极及其制备方法，通过同时对两种价态的二茂铁进行固定，来提高酶电极的稳定性；本专利技术的目的还在于提供该多步固定修饰的酶电极在长期动态检测血糖中的应用。本专利技术的目的通过以下技术方案得以实现：一方面，本专利技术提供一种基于多步固定修饰的酶电极的制备方法，其包括以下步骤：步骤一，将β-环糊精溶解于戊二醛的水溶液中，得到溶液A；向溶液A中加入二茂铁和/或二茂铁衍生物混合溶解，得到溶液B；步骤二，将溶液B与Nafion溶液(购买于杜邦公司，浓度为20％)混合至沉淀消失后得到透明的溶液C；步骤三，向溶液C中加入牛血清白蛋白、葡萄糖氧化酶和戊二醛的水溶液进行充分交联反应，得到溶液D；步骤四，将溶液D修饰到基底电极的工作电极区域的表面，得到初步修饰的酶电极；步骤五，将有机高分子聚合物溶液修饰到酶电极的工作电极区域的表面，烘干成膜后得到固定修饰的酶电极。本专利技术中，专利技术人通过对二茂铁及其衍生物采取三步固定修饰制备获得酶电极。采用主客体的方式对二茂铁及其衍生物进行初步的修饰固定，使二茂铁及其衍生物能够初步吸附在环糊精的有机官能团中心；进一步将二茂铁及其衍生物的环糊精的溶液与Nafion进行共混合，Nafion作为带强烈负电的高分子聚合物能够将阳离子态的二茂铁牢牢吸附在电极表面，防止其从电极上流失，实现第二步的修饰固定；通过与酶液混合，得到最终的酶修饰液，实现酶与电子传递剂直接混合的单层生物响应传感层，提高二茂铁及其衍生物与酶之间的电子传递效率；然后通过有机高分子聚合物溶液对生物传感层表面继续修饰一层致密的有机高分子膜层，进一步减缓二茂铁主客体及其他酶电极组成成分的流失，实现第三步的修饰固定，采取三步固定法能够有效防止零价态和阳离子氧化态二茂铁的流失。本专利技术采用环糊精与Nafion对两种价态二茂铁的吸附固定作用产生的叠加效应，有效解决了电子传递剂酶电极固定二茂铁与其阳离子产物无法兼顾的缺点；此外，采用更加致密的有机高分子聚合物的膜结构对二茂铁的生物酶层统一包覆，进一步提高了二茂铁酶电极的稳定性。本专利技术利用多组分、多步骤固定的方式将二茂铁及其衍生物稳定修饰在酶电极上，得到的电极能够用于葡萄糖长时间的稳定监测。上述的制备方法，优选地，所述二茂铁衍生物可以包括乙烯基二茂铁和/或甲基二茂铁等。上述的制备方法，优选地，在步骤一的溶液B中，所述β-环糊精的浓度为10-70mg/mL；所述二茂铁和/或二茂铁衍生物的总浓度为0.5-2mg/mL；所述戊二醛的质量分数为5％-10％；所述戊二醛的水溶液的浓度为50％。上述的制备方法，优选地，步骤一具体步骤为：将β-环糊精溶解于戊二醛的水溶液中，得到溶液A；向溶液A中加入二茂铁和/或二茂铁衍生物并本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于多步固定修饰的酶电极的制备方法，其包括以下步骤：步骤一，将β‑环糊精溶解于戊二醛的水溶液中，得到溶液A；向溶液A中加入二茂铁和/或二茂铁衍生物混合溶解，得到溶液B；步骤二，将溶液B与Nafion溶液混合至沉淀消失后得到透明的溶液C；步骤三，向溶液C中加入牛血清白蛋白、葡萄糖氧化酶和戊二醛的水溶液进行充分交联反应，得到溶液D；步骤四，将溶液D修饰到基底电极的工作电极区域的表面，得到初步修饰的酶电极；步骤五，将有机高分子聚合物溶液修饰到酶电极的工作电极区域的表面，烘干后得到固定修饰的酶电极。

【技术特征摘要】
1.一种基于多步固定修饰的酶电极的制备方法，其包括以下步骤：步骤一，将β-环糊精溶解于戊二醛的水溶液中，得到溶液A；向溶液A中加入二茂铁和/或二茂铁衍生物混合溶解，得到溶液B；步骤二，将溶液B与Nafion溶液混合至沉淀消失后得到透明的溶液C；步骤三，向溶液C中加入牛血清白蛋白、葡萄糖氧化酶和戊二醛的水溶液进行充分交联反应，得到溶液D；步骤四，将溶液D修饰到基底电极的工作电极区域的表面，得到初步修饰的酶电极；步骤五，将有机高分子聚合物溶液修饰到酶电极的工作电极区域的表面，烘干后得到固定修饰的酶电极。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述二茂铁衍生物包括乙烯基二茂铁和/或甲基二茂铁。3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：在步骤一的溶液B中，所述β-环糊精的浓度为10-70mg/mL；所述二茂铁和/或二茂铁衍生物的总浓度为0.5-2mg/mL；所述戊二醛的质量分数为5％-10％；优选地，步骤一具体步骤为：将β-环糊精溶解于戊二醛的水溶液中，得到溶液A；向溶液A中加入二茂铁和/或二茂铁衍生物并在18℃-25℃温度下用以400-2000转/min的速度搅拌12-24h，使其充分溶解，得到溶液B。4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：在步骤二的溶液C...

【专利技术属性】
技术研发人员：肖通方，牛珊珊，李元光，
申请(专利权)人：北京怡成生物电子技术股份有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11