一种双引物及其应用制造技术

本发明专利技术属于生物技术领域，涉及一种双引物及其应用，具体涉及一种用于滚环扩增/鉴定环形核酸的双引物，其组成的反应体系，其组成的试剂盒及其应用，所述双引物为分散型引物，所述双引物中的第一引物和第二引物的3’端的距离为0‑1000bp，所述双引物能够对环形DNA/RNA进行分子鉴定，所述鉴定方法准确、快速、便捷、直观，为新型环形DNA/RNA的发现提供有效手段。

A Double Primer and Its Application

【技术实现步骤摘要】
一种双引物及其应用
本专利技术属于生物
，涉及一种双引物及其应用，具体涉及一种用于滚环扩增/鉴定环形核酸的双引物，其组成的反应体系，其组成的试剂盒及其应用。
技术介绍
Phi29DNApolymerase(简称Phi29酶)是一种具有较高连续合成能力以及链置换的核酸聚合酶，是常用的PCR扩增酶。一般的PCR扩增往往具有偏好性导致扩增时产生大量的冗余，导致扩增不准、并影响扩增产物在测序中的检测结果。Phi29酶扩增方向为5'→3'，具有3'→5'外切酶校正活性，可切掉沿3'→5'反向非特异性扩增的产物，以减少非特异性扩增。因此，近年来Phi29酶多作为测序分析前扩增核酸的一种工具被开发，用来扩增待测DNA/RNA。目前，基于phi29酶扩增的测序技术主要有多重置换扩增(Multipledisplacementamplification，简称MDA)和多次退火环状循环扩增技术(Multipleannealingandloopingbasedamplificationcycles，简称MALBAC)(谢晓亮，2012)。这些技术主要面向单细胞测序或全基因组扩增测序，他们使用多种引物引导Phi29酶扩增基因组的多处的DNA，新生成的链会置换掉旧链，形成基因组多处多个高保真拷贝，以此达到全基因组测序片段的要求。然而，对于分子量相对较小的环状DNA/RNA来说，这种方法并不实用。首先，多个引物的设计会增加反应过程的复杂程度，其次，也会在测序时增加碱基读取的难度。以环形核酸分子为模版，启用Phi29酶时的扩增方式为滚环扩增(Rollingcircleamplification，简称RCA)，在不同数量的引物下，扩增方式有所不同，包括单一引物时线性扩增RCA(图1A)，多引物时多支链网状结构的RCA扩增方式(图1B，1C)，且扩增产物在凝胶电泳中呈现连续状态，说明产物分子量连续，结构多样(图1D)，但无论是哪种扩增方式，Phi29酶催化下的碱基增长速度极快，且错配率较其他核酸聚合酶低，在分子鉴定、基因检测、克隆技术上都有巨大的应用潜力和商业价值。目前，基于RCA反应的检测技术主要有以下几种：(1)AliMM等(2009)通过在RCA反应时掺入染料标记的dNTP来标记RCA扩增产物，以达到测定待测模版链的拷贝数的目的，并建立了基于RCA反应的real-timePCR实验方法；(2)在滚环扩增基础上被开发出了面向单核苷酸多态性检测的锁式探针技术(Padlockprobe)(LizardiPM等，1998；GomezA等，2014；ShiD等，2014)，反应时待测物为较短的线性DNA(RCA的模版DNA)，反应原理为，只有在和引物互补的情况下，模版DNA才会两头与引物互补成环，并在Phi29或其他DNA聚合酶的催化下发生RCA反应，这项技术中互补的引物即为探针，类似于将待测线性DNA分子锁定在探针上，通过设计探针的DNA序列，可以很好的应用在单核苷酸多态相关的基因诊断中；(3)传统对免疫芯片信号扩散能力不足，无法兼顾高通量和高灵敏度，但将RCA、微阵列技术和免疫相结合的RCA反应的免疫芯片，却可以克服该难题，实现多元高通量并行分析蛋白质芯片(Miller等，2003；ZhouH等，2004；Cheng等，2010)。目前，国内外基于Phi29酶RCA反应的、专门面向环形DNA/RNA分子的快速鉴定的技术尚未有报道。然而，(1)质粒/DNA载体(环形DNA分子)的测序占据了测序市场上很大的份额，普通的测序技术只能读取到测序引物后300～500bp作用的位置，全长测序的费用又非常昂贵，Phi29酶高保真、快速的扩增能力及RCA反应特征适用于传统质粒/DNA载体分子的快速鉴定；(2)环形RNA作为近年来被发现的新型RNA分子，因其独特的环形结构不被RNA酶分解而被看作是稳定的具有极大潜力的biomarker，同时环形RNA相关的机制研究也为近年的热点，建立一种快速鉴定环形RNA甚至测定环形RNA的方法，无论是在临床应用或是科研上，都有很大的市场应用前景。
技术实现思路
针对现有技术的不足及实际需求，本专利技术提供一种双引物及其应用，具体涉及一种可高效扩增的双引物设计方法及其应用，所述双引物能够对环形DNA/RNA进行分子鉴定，所述鉴定方法准确、快速、便捷、直观，为新型环形DNA/RNA的发现提供有效手段。为达到此专利技术的目的，本专利技术采用以下技术方案：一方面，本专利技术提供了一种双引物，所述双引物为分散型引物，所述双引物中的第一引物和第二引物的3’端的距离为0-1000bp。本专利技术中，所述分散型引物指的是在特定的距离上，使得一个引物正向扩增，一个引物反向扩增，且第一引物与第二引物的5’端以相离的方式进行设计，其中3’端的距离为0-1000bp，专利技术人意外发现，采用分散型引物相比于聚集型引物(第一引物与第二引物的5’端以相对的方式进行设计)效果更好，不仅如此，专利技术人还发现第一引物与第二引物的3’端具有特定的距离，能够显著提高扩增效率。根据本专利技术，所述双引物中的第一引物和第二引物的3’端的距离为0-1000bp，例如可以是0bp、1bp、2bp、3bp、4bp、5bp、6bp、7bp、8bp、9bp、10bp、12bp、15bp、18bp、20bp、22bp、25bp、28bp、30bp、32bp、35bp、38bp、40bp、42bp、45bp、48bp、50bp、51bp、52bp、53bp、55bp、58bp、60bp、62bp、65bp、68bp、70bp、75bp、80bp、85bp、90bp、95bp、100bp、110bp、120bp、130bp、140bp、150bp、160bp、180bp、200bp、220bp、230bp、250bp、280bp、300bp、320bp、350bp、380bp、400bp、420bp、450bp、460bp、480bp、500bp、520bp、530bp、550bp、560bp、580bp、600bp、620bp、650bp、680bp、700bp、720bp、750bp、780bp、800bp、820bp、850bp、900bp、920bp、950bp、980bp或1000bp等，优选为0-800bp，进一步优选为0-500bp，最优选为0-200bp。根据本专利技术，所述第一引物的长度为19-26bp，例如可以是19bp、20bp、21bp、22bp、23bp、24bp、25bp或26bp。根据本专利技术，所述第二引物的长度为19-26bp，例如可以是19bp、20bp、21bp、22bp、23bp、24bp、25bp或26bp。根据本专利技术，所述第一引物的Tm值为53-67℃，例如可以是53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃或67℃等。根据本专利技术，所述第二引物的Tm值为53-67℃，例如可以是53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃或67℃等。本专利技术中，所述第一引物和第二引物的设计可以根据需要滚环扩增或鉴定的环形DNA/RNA模板进行设计，需本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种双引物，其特征在于，所述双引物为分散型引物，所述双引物中的第一引物和第二引物的3’端的距离为0‑1000bp。

【技术特征摘要】
1.一种双引物，其特征在于，所述双引物为分散型引物，所述双引物中的第一引物和第二引物的3’端的距离为0-1000bp。2.根据权利要求1所述的双引物，其特征在于，所述双引物中的第一引物和第二引物的3’端的距离为0-800bp，优选为0-500bp，进一步优选为0-200bp；优选地，所述第一引物的长度为19-26bp；优选地，所述第二引物的长度为19-26bp；优选地，所述第一引物的Tm值为53-67℃；优选地，所述第二引物的Tm值为53-67℃。3.一种滚环扩增的反应体系，其特征在于，所述反应体系包括权利要求1或2所述的双引物；优选地，所述反应体系中还包括模板；优选地，所述模板为DNA或RNA模板；优选地，所述模板的摩尔浓度为(1-5)×10-13mol；优选地，所述模板：第一引物：第二引物的摩尔比为1:(102-103):(102-103)；优选地，所述反应体系还包括dNTP、BSA、Phi29酶、Phi29酶反应缓冲液；优选地，所述dNTP的浓度为5-20μM，优选为8-15μM；优选地，所述BSA的浓度为200-600μg/ml优选为400μg/ml；优选地，所述Phi29酶的单位为1-5U，优选为2-3U；优选地，所述Phi29酶反应缓冲液相对于20μL的总反应体系的加入量为0.1-0.5μL，优选为0.2-0.3μL。4.一种鉴定环形DNA/RNA的反应体系，其特征在于，包括如权利要求1或2所述的双引物；优选地，所述反应体系还包括dNTP、BSA、T4DNA连接酶、T4DNA连接酶缓冲液、限制性内切酶和限制性内切酶缓冲液；优选地，所述dNTP的浓度为5-20μM，优选为8-15μM；优选地，所述BSA的浓度为800-1200μg/ml；优选地，所述T4DNA连接酶使用量为0.3-1.5U，优选为0.6-1U；优选地，所述T4DNA连接酶反应缓冲液相对于40μL的总反应体系的加入量为0.1-0.5μL，优选为0.2-0.3μL；优选地，所述限制性内切酶的用量为2-10U，优选为4-8U；。5.一种...

【专利技术属性】
技术研发人员：汪雪，金柳，王孟强，
申请(专利权)人：汪雪，上海索境生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31