一种低分子葡聚糖铁的制备方法及其应用技术

本发明专利技术提供了一种重均分子量在1500‑4000Da之间的葡聚糖铁的制备方法与应用。具体是以麦芽糖和蔗糖为底物，在葡聚糖蔗糖酶的作用下与三氯化铁络合制备得到低分子葡聚糖溶液，并使用该葡聚糖铁溶液制备低分子量的葡聚糖铁注射液。本发明专利技术以小分子聚合的方式代替常规大分子降解的方法，制备出分子量较低的葡聚糖铁注射液，以廉价的麦芽糖和蔗糖为底物，制备成本低；并通过调整底物麦芽糖和蔗糖的比例来制备不同糖链长度的葡聚糖铁；在铁的络合过程中引入络合催化剂提高络合效率；所得低分子葡聚糖注射液具有刺激性小、吸收好、补铁效果佳等优点，可作为猪、牛、羊等家畜的优选补铁剂。

A preparation method of low molecular weight iron glucan and its application

【技术实现步骤摘要】
一种低分子葡聚糖铁的制备方法及其应用
本专利技术属于兽用补铁药物领域，具体涉及一种低分子葡聚糖铁的制备方法及其应用。
技术介绍
葡聚糖，又称右旋糖酐，是指以葡萄糖为单糖组成的同型多糖。葡聚糖链长短的不同决定了其药用价值不同，长链葡聚糖通常为血容量扩充药，分子量在几万到十几万；而短链葡聚糖可以与氢氧化铁进行络合，制成葡聚糖铁，即右旋糖酐铁。葡聚糖铁作为兽用补铁制剂，多为注射液，供肌肉注射用，多用于仔猪或母猪的补铁。研究表明，仔猪出生时体内只有约50mg铁，每天从母猪母乳中可以获得1mg铁，但是仔猪正常生长需要每天补充7mg铁，如果得不到有效补充措施，会导致仔猪生产缓慢、抵抗力低下、体重减轻，死亡率高等。葡聚糖铁是目前国内公认较好的用于仔猪或母猪的补铁剂。中国药典2015年版规定的右旋糖酐铁的重均分子量应在5000-7500Da之间,分布系数D(MW/Mn)应小于1.8，目前国内厂商生产的产品也是按照这个标准进行，但是目前国内相关市售制剂存在着较明显的副作用。经市场人员对多家猪场及市面上补血产品的调查反馈，一些市售葡聚糖铁注射液产品，对猪注射后，会产生明显的刺激性，注射部位会有大约2～3cm2的着色，严重的甚至有几率出现整条腿着色不下退的情况，个别有母猪致死案例；这些产品的重均分子量较大，分子量布较宽，较大的分子量会影响肌注后机体对药物的吸收，造成注射部位有深褐色的坏死灶而影响胴体质量。而从欧洲进口的某品牌的葡聚糖铁注射液重均分子量在4000-5000Da，大大减轻了上述不良反应，且推针较为顺畅。根据以上所述，葡聚糖铁分子量的大小会对用药的刺激性造成不同影响。为了制备低分子量的葡聚糖铁，减小不良反应，中国专利CN101205256A提出直接利用右旋糖酐5(重均分子量4500-5500Da)为底物进行降解，原料成本偏高；分子量的降解采用酸加热的方法，需要大量的碱来中和，增加了“三废”处理压力，且高温长时间的降解过程，能耗很高，进一步增加了生产成本。中国专利CN1041762A提出了用碱解法来降解分子量较大的右旋糖酐，需要大量的酸来中和，同样是存在原料成本高、“三废”处理压力大、能耗成本高等缺点。中国专利CN102942638A公开了一种重均分子量为3000-6000Da的右旋糖酐的制备方法：具体是以重均分子量为7000-80000Da的右旋糖酐为底物，在右旋糖酐酶的作用下，降解生成重均分子量为3000-6000Da的右旋糖酐。虽然使用酶解法相对酸解法和碱解法而言有所改进，但得到的低分子葡聚糖链长短不一，且通过该方法得到的特定分子量的葡聚糖链，经分离纯化后的收率较低，生产成本较高。因此，国内家畜养殖场急需一种生产成本低，污染小，且易于工业化，且重均分子量较小、铁含量高的葡聚糖铁的制备方法，以及一种不仅铁吸收率高，且刺激性小的葡聚糖铁注射液。
技术实现思路
本专利技术旨在解决现有技术存在的缺陷，提供一种低分子葡聚糖铁的制备方法及其应用。该方法以麦芽糖为起始底物，用葡聚糖蔗糖酶将蔗糖分子中的葡萄糖苷连接到起始底物，同时脱除果糖，生成分子量较低的葡聚糖链，再加入络合催化剂，经活化后与铁进行络合制备得到重均分子量在1500-4000Da之间的低分子葡聚糖铁，并将其应用于葡聚糖铁注射液的制备。本专利技术原料廉价易得、通过酶连接法制备低分子葡聚糖链，选择性高，收率好；使用络合催化剂提高了铁的络合效果，提高了铁含量。所得葡聚糖铁溶液可应用于低分子葡聚糖注射液的制备，尤其是分子量在2000-3000Da之间的葡聚糖铁注射液的制备，该注射液不仅铁吸收率高，还具有着色浅、刺激性小，耐受性好等优点，在家畜补铁方面效果显著。本专利技术的技术方案如下：第一方面，提供了一种低分子葡聚糖的制备方法，所述葡聚糖铁重均分子量在1500-4000Da之间，主要包括1500-2000Da、2000-3000Da、3000-4000Da三个分子段，具体包括以下步骤：(1)低分子葡聚糖溶液的制备：制备一定浓度的蔗糖/麦芽糖的混合溶液；加入氯化钙，用醋酸调节pH至5.0-6.0，加入葡聚糖蔗糖酶；15-30℃下搅拌20～40h；将反应液加热至70-100℃并持续搅拌1-2h，使酶失活；过滤除去蛋白杂质及其他不溶性杂质，得到低分子葡聚糖溶液。所得溶液不需经纯化和固化，可直接用于下一步反应。(2)低分子葡聚糖铁溶液的制备：向步骤(1)中所得葡聚糖溶液中加入络合催化剂，70-100℃搅拌0.5-3h，加20％氢氧化钠溶液，70-100℃搅拌6-10h；将反应体系降温至50-70℃，用盐酸溶液调节pH至5.0-6.0，滴加2.0mol/L三氯化铁溶液，同时滴加20％氢氧化钠溶液使pH在5.0-6.0之间，70-100℃搅拌10-20h，得到低分子葡聚糖铁粗品溶液。(3)低分子葡聚糖铁溶液的分离纯化：将葡聚糖铁粗品溶液过滤除去不溶性杂质；将滤液用超滤柱A超滤，将原液超滤至原体积的1/10，加入至原液同体积的水，重复3次，收集滤过液；用超滤柱B进行超滤，此次弃掉滤过液，收集原液至原体积的1/10，加入至原液相同体积的水，重复3次，得到纯化后的低分子葡聚糖铁溶液。步骤(1)中所述蔗糖/麦芽糖的混合溶液中蔗糖含量为10-40％，麦芽糖含量为2-10％。步骤(1)中所述氯化钙的加入量为每100mL混合溶液中加入0.01g-0.05g。步骤(1)中所述葡聚糖蔗糖酶的加入量为每1mL混合溶液中加入10-15U。步骤(2)中所述的络合催化剂为柠檬酸钠；所述柠檬酸钠的加入量为每100mL葡聚糖溶液中加入3-6g。步骤(2)中所述第一次滴加氢氧化钠溶液的体积为每100mL葡聚糖溶液中加入15-25mL。步骤(2)中所述三氯化铁溶液的加入量为每100mL葡聚糖溶液中加入15-25mL。步骤(3)中所述超滤柱A的孔径为0.05-0.1μm；所述超滤柱B为截留分子量3000-10000Da的中空纤维柱。第二方面，提供了一种低分子葡聚糖铁在用于制备低分子葡聚糖铁制剂中的应用。所述低分子葡聚糖铁制剂可以包括但不限于注射液、口服液、片剂、颗粒剂等剂型。所述低分子葡聚糖铁制剂可用于制备防治家畜，尤其是猪、牛、羊等缺铁性贫血的药物。第三方面，提供了一种重均分子量在2000-3000Da之间的葡聚糖铁注射液的制备方法，具体步骤为：将上述低分子葡聚糖的制备方法步骤(3)中纯化后的分子量在2000-3000Da之间的低分子葡聚糖溶液，在真空度为0.1—-0.09Mpa，温度为30-100℃的条件下浓缩到铁含量为150-250mg/mL；加入苯酚，用10％的磷酸调节pH值至5.5-6.2，用注射用水定容至所需体积，0.22μm微孔滤膜过滤，灌装，100-120℃下灭菌15-30min，即得到所需铁含量的所需重均分子量的葡聚糖铁注射液产品。所述苯酚的加入量为注射液总体积的0.1-0.3％。所述葡聚糖铁分子量及铁含量的测定是按照《2015版中国药典》右旋糖酐铁注射液中相应的检测方法进行。有益效果：(1)本专利技术使用葡聚糖蔗糖酶连接法，相对于酶切法，原料廉价易得，制备低分子葡聚糖的选择性更好、效率更高。(2)该方法制备得到低分子葡聚糖后不需经处理纯化，可直接用于低分子葡聚糖铁溶液的制备，属于连投反应，简化了操作，降低本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种低分子葡聚糖铁的制备方法，其特征在于，所述葡聚糖铁重均分子量在1500‑4000Da之间，主要包括1500‑2000Da、2000‑3000Da、3000‑4000Da三个分子段，其制备步骤如下：(1)低分子葡聚糖溶液的制备：制备一定浓度的蔗糖/麦芽糖的混合溶液，加入氯化钙，用醋酸调节pH至5.0‑6.0，加入葡聚糖蔗糖酶；15‑30℃下搅拌20～40h；将反应液加热至70‑100℃并持续搅拌1‑2h，使酶失活；过滤除去蛋白杂质及其他不溶性杂质，得到低分子葡聚糖溶液；(2)低分子葡聚糖铁溶液的制备：向步骤(1)中所得低分子葡聚糖溶液中加入络合催化剂，70‑100℃搅拌0.5‑3h，加20％氢氧化钠溶液，70‑100℃搅拌6‑10h；降温至50‑70℃，用盐酸溶液调节pH至5.0‑6.0，滴加2.0mol/L三氯化铁溶液，同时滴加20％氢氧化钠溶液使pH在5.0‑6.0之间，70‑100℃搅拌10‑20h，得到低分子葡聚糖铁粗品溶液；(3)低分子葡聚糖铁溶液的分离纯化：将葡聚糖铁粗品溶液过滤除去不溶性杂质；将滤液用超滤柱A超滤，将原液超滤至原体积的1/10，加入至原液同体积的水，重复3次，收集滤过液；再用超滤柱B进行超滤，弃滤过液，收集原液至原体积的1/10，加入至原液相同体积的水，重复3次，得到纯化后的低分子葡聚糖铁溶液。...

【技术特征摘要】
1.一种低分子葡聚糖铁的制备方法，其特征在于，所述葡聚糖铁重均分子量在1500-4000Da之间，主要包括1500-2000Da、2000-3000Da、3000-4000Da三个分子段，其制备步骤如下：(1)低分子葡聚糖溶液的制备：制备一定浓度的蔗糖/麦芽糖的混合溶液，加入氯化钙，用醋酸调节pH至5.0-6.0，加入葡聚糖蔗糖酶；15-30℃下搅拌20～40h；将反应液加热至70-100℃并持续搅拌1-2h，使酶失活；过滤除去蛋白杂质及其他不溶性杂质，得到低分子葡聚糖溶液；(2)低分子葡聚糖铁溶液的制备：向步骤(1)中所得低分子葡聚糖溶液中加入络合催化剂，70-100℃搅拌0.5-3h，加20％氢氧化钠溶液，70-100℃搅拌6-10h；降温至50-70℃，用盐酸溶液调节pH至5.0-6.0，滴加2.0mol/L三氯化铁溶液，同时滴加20％氢氧化钠溶液使pH在5.0-6.0之间，70-100℃搅拌10-20h，得到低分子葡聚糖铁粗品溶液；(3)低分子葡聚糖铁溶液的分离纯化：将葡聚糖铁粗品溶液过滤除去不溶性杂质；将滤液用超滤柱A超滤，将原液超滤至原体积的1/10，加入至原液同体积的水，重复3次，收集滤过液；再用超滤柱B进行超滤，弃滤过液，收集原液至原体积的1/10，加入至原液相同体积的水，重复3次，得到纯化后的低分子葡聚糖铁溶液。2.根据权利要求1所述的低分子葡聚糖铁的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述蔗糖/麦芽糖混合溶液中含蔗糖为10-40％，含麦芽糖为2-10％；所述氯化钙的加入量为每100mL溶液中加入0.01g-0.05g。3.根据权利要求1所述的低分子葡聚糖铁的制备方法，其特...

【专利技术属性】
技术研发人员：王彪，李亚玲，吴燕子，刘爱玲，李守军，夏雪林，
申请(专利权)人：瑞普天津生物药业有限公司，
类型：发明
国别省市：天津,12