一种皱纹盘鲍三倍体的诱导方法技术

一种皱纹盘鲍三倍体的诱导方法，涉及贝类的培育方法。种鲍的选择及促熟；人工催产；配子的选择和处理；同步受精；药物诱导；药物去除；孵化。以确保皱纹盘鲍种鲍性腺成熟度、同步受精为前提，进一步优化诱导条件从而高效稳定的获得皱纹盘鲍三倍体。确保同步受精：严格避免配子在排放过程中提前接触，镜检确认不存在意外受精，保证同步受精和受精卵发育的一致性。优化诱导条件：以时时镜检观察确定对照组受精卵PB1比例70％～80％作为处理时间节点，确保第一极体有效释放，避免出现四倍体和非整倍体。稳定高效的诱导率：三倍体诱导率为100％或接近于100％。

A Triploid Induction Method for Haliotis discus hannai

【技术实现步骤摘要】
一种皱纹盘鲍三倍体的诱导方法
本专利技术涉及贝类的培育方法，尤其是涉及一种皱纹盘鲍三倍体的诱导方法。
技术介绍
鲍是名贵的海珍品，被誉为“海产八珍“之首。而我国作为世界第一养鲍大国，2017年全国鲍鱼总产量为14.85万吨，年产值超两百亿元。目前，我国鲍的主要养殖种类为皱纹盘鲍(Haliotisdiscushannai)，养殖范围自我国北方黄渤海地区延伸至福建沿岸，其中福建省养殖产量高达至12.34万吨(2017年)，占全国鲍总产量的83.1％。然而，在福建海区，秋季为皱纹盘鲍的繁殖盛期，此时海区养殖皱纹盘鲍的性腺发育饱满，易排放精卵，性腺排放后养殖鲍体质虚弱，在环境胁迫下易导致死亡。另一方面，近十年来在鲍苗培育期间广泛采用配合饲料作为主要饲料，鲍苗生长到壳长3.0～3.5cm时性腺发育明显，出现性早熟现象，在水泥池高密度培育条件下容易因集中性腺排放而致大量死亡，同时出现滞长，这是我国鲍鱼主养区出现的新问题，亟需解决。采用理化方法或生物学杂交可获得贝类三倍体，由于比二倍体多增加了一套染色体组，通常情况下三倍体不育或者育性差，在繁殖季节仅需消耗少量能量用于性腺发育，可以避免养殖贝类因性腺排放而导致体质虚弱致死或滞长问题。自1981年，Stanley首次使用细胞松弛素B(CB)诱导获得三倍体美洲牡蛎(Crassostreavirginica)以来，国内外学者已经对包括牡蛎、扇贝、贻贝、珍珠贝和鲍在内的20多种贝类相继开展了多倍体育种工作。有关皱纹盘鲍三倍体的研究工作最早始于1986年，据《大连水产学院学报》(1990年第1期)报道，以0.3mg/L的CB处理皱纹盘鲍受精卵，三倍体率最高仅为51.3％。《水产学报》(1993年第3期)报道使用1.0mg/L的CB诱导皱纹盘鲍三倍体，诱导率最高可达81.0％。中国专利CN1733908A中，使用150μmol/L6-二甲基氨基嘌呤(6-DMAP)最高可获得54.0％的三倍体皱纹盘鲍。《水产科技情报》(2013年第4期)以0.70mg/L的CB处理受精卵，稚鲍三倍体率则为66.0％。目前皱纹盘鲍三倍体制种技术存在以下不足：1、性腺成熟度、同步受精和受精阶段同步性无法充分保证；2、包括起始诱导时间、诱导浓度和作用持续时间在内的诱导条件未能进一步精确和优化。因此出现倍化率不高，操作稳定性差等问题，未能形成成熟稳定的皱纹盘鲍三倍体制种技术。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了解决现有杂交技术所存在的诱导率低和稳定性差等问题，提供一种高效稳定的皱纹盘鲍三倍体的诱导方法。本专利技术包括以下步骤：1)种鲍的选择及促熟；在步骤1)中，所述种鲍的选择及促熟的具体方法可为：取壳长为70～130mm，个体活力良好且无外部损伤的皱纹盘鲍作为种鲍，按雌雄分别放置于亲鲍培育池中促熟；所述种鲍可为2～3龄皱纹盘鲍；所述亲鲍培育池内性别特征必须单一。2)人工催产；在步骤2)中，所述人工催产的具体方法可为：采用阴干结合紫外线照射海水的方法对性腺发育成熟的个体进行催产，直至雌雄种鲍产卵和排精为止；所述阴干的方法是阴干60～120min后，将雌雄个体严格区分置于标记清楚的不同容器中，注入照射强度为500～1200mWh/L紫外线处理海水，每隔60min更换一次直至配子排放，期间注意防止意外受精。3)配子的选择和处理；在步骤3)中，所述配子的选择和处理的具体方法可为：使用150μm的筛绢滤除步骤2)配子中的杂质，镜检确定卵子质量和精子活力；所述镜检是指镜检质量高的卵液中卵子应卵膜完整、形状规则且不存在意外受精，活力好的精子应活动性和分散度良好。4)同步受精；在步骤4)中，所述同步受精的具体方法可为：将步骤3)中确定的活力好和质量高的精子和卵子混合，分为处理组和对照组，所述精子与卵子的质量比可为(10～7)︰1。所述受精的温度可为18～23℃，盐度为30～35。5)药物诱导；在步骤5)中，所述药物诱导的具体方法可为：观察对照组受精卵发育情况，第一极体出现比例为50％～80％时，迅速将处理组内受精卵加入至浓度为1.50～1.75mg/L的CB诱导液中处理15～20min或30～40mg/L的6-DMAP诱导液中处理10～15min；所述第一极体的观察应时时取样置于显微镜下观测；所述CB诱导液可为CB溶于DMSO所配制的1mg/mL的储存液稀释获得，所述6-DMAP诱导液可为6-DMAP溶于DMSO所配制的50mg/mL的储存液稀释获得。6)药物去除；在步骤6)中，所述药物去除的具体方法可为：药物处理后将受精卵置于1％的二甲基亚砜(DMSO)中清洗2次，每次15min。7)孵化。在步骤7)中，所述孵化可按照常规孵化及后期培育方法进行，使用流式细胞仪确定面盘幼虫三倍体率。与已有的生产方法相比，本专利技术以确保皱纹盘鲍种鲍性腺成熟度、同步受精为前提，进一步优化诱导条件从而高效稳定的获得皱纹盘鲍三倍体。本专利技术具有以下突出的优点：1、确保同步受精：严格避免配子在排放过程中提前接触，镜检确认不存在意外受精，保证同步受精和受精卵发育的一致性。2、优化诱导条件：以时时镜检观察确定对照组受精卵PB1比例70％～80％作为处理时间节点，确保第一极体有效释放，避免出现四倍体和非整倍体。3、稳定高效的诱导率：以往皱纹盘鲍三倍体诱导率在50％～80％间变化，而本专利技术的三倍体诱导率为100％或接近于100％，不同药物诱导皱纹盘鲍三倍体试验结果见表1。表1具体实施方式以下实施例将对本专利技术作进一步的说明。实施例11)取个体活力良好、无外部损伤的皱纹盘鲍做为种鲍，皱纹盘鲍平均壳长76.09±9.57mm，壳宽50.66±4.19mm，湿重55.50±13.88g，将种鲍按照雌雄分别放置在不同的亲鲍培育池中进行饲育，每个亲鲍培育池内亲鲍的性别特征必须单一。2)待种鲍性腺发育成熟后，阴干60min，随后分别将雌雄个体置于标记清楚的不同容器中，注入照射强度为1000mWh/L紫外线处理海水，海水水温22℃，每隔60min更换一次紫外线处理海水，直至配子排放，操作过程严格防止精卵接触。3)使用150μm的筛绢分别滤除精卵中的杂质，镜检确定卵子质量和精子活力，确保卵子中无受精卵，将镜检确定的卵子和精子分别置于50L和10L塑料箱中备用。4)将备用精卵混合，镜检精子与卵子的个数比例为(10～7)︰1，之后将受精卵一分为三，分别标记为DD，DDD-CB和DDD-6-DMAP。5)时时镜检观察对照组受精卵发育情况，当PB1比例为60％时，将实验组DDD-CB和DDD-6-DMAP中受精卵分别置于浓度为1.50mg/L的CB中处理15min和30mg/L的6-DMAP处理15min。6)计时结束后，将受精卵置于1％DMSO中清洗2次，每次15min。7)按照常规的孵化及后期培育方法即可获得皱纹盘鲍三倍体种苗。取面盘幼虫(24h)，采用流式细胞仪测定倍性，DDD-CB和DDD-6-DMAP的三倍体诱导率分别为89.62±4.64％和100.00±0.00％。8)受精及面盘幼虫孵化过程中海水温度为20.7～21.5℃。实施例21)取个体活力良好、无外部损伤的皱纹盘鲍做为种鲍，皱纹盘鲍平均壳长72.94±3.31mm，壳宽48.73±3.50mm，湿重50.93±本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种皱纹盘鲍三倍体的诱导方法，其特征在于包括以下步骤：1)种鲍的选择及促熟；2)人工催产；3)配子的选择和处理；4)同步受精；5)药物诱导；6)药物去除；7)孵化。

【技术特征摘要】
1.一种皱纹盘鲍三倍体的诱导方法，其特征在于包括以下步骤：1)种鲍的选择及促熟；2)人工催产；3)配子的选择和处理；4)同步受精；5)药物诱导；6)药物去除；7)孵化。2.如权利要求1所述一种皱纹盘鲍三倍体的诱导方法，其特征在于在步骤1)中，所述种鲍的选择及促熟的具体方法为：取壳长为70～130mm，个体活力良好且无外部损伤的皱纹盘鲍作为种鲍，按雌雄分别放置于亲鲍培育池中促熟；所述种鲍为2～3龄皱纹盘鲍；所述亲鲍培育池内性别特征必须单一。3.如权利要求1所述一种皱纹盘鲍三倍体的诱导方法，其特征在于在步骤2)中，所述人工催产的具体方法为：采用阴干结合紫外线照射海水的方法对性腺发育成熟的个体进行催产，直至雌雄种鲍产卵和排精为止。4.如权利要求3所述一种皱纹盘鲍三倍体的诱导方法，其特征在于所述阴干的方法是阴干60～120min后，将雌雄个体严格区分置于标记清楚的不同容器中，注入照射强度为500～1200mWh/L紫外线处理海水，每隔60min更换一次直至配子排放，期间注意防止意外受精。5.如权利要求1所述一种皱纹盘鲍三倍体的诱导方法，其特征在于在步骤3)中，所述配子的选择和处理的具体方法为：使用150μm的筛绢滤除步骤2)配子中的杂质，镜检确定卵子质量和精子活力；所述镜检是指镜检质量高的卵液中卵子应卵膜完整、形状规则且不存在意外受精，活力好的精子应活动性和分散度良好...

【专利技术属性】
技术研发人员：王怡，骆轩，游伟伟，柯才焕，王星泽，
申请(专利权)人：厦门大学，
类型：发明
国别省市：福建,35