一种线粒体靶向的次氯酸根双光子荧光探针及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种线粒体靶向的次氯酸根双光子荧光探针及其制备方法和应用，属于分析化学技术领域。本发明专利技术的技术方案要点为：一种线粒体靶向的次氯酸根双光子荧光探针，其结构式如下：

A Mitochondrial Targeted Hypochlorite Two-photon Fluorescence Probe and Its Preparation and Application

【技术实现步骤摘要】
一种线粒体靶向的次氯酸根双光子荧光探针及其制备方法和应用
本专利技术属于分析化学
，具体涉及一种线粒体靶向的次氯酸根双光子荧光探针及其制备方法和应用。
技术介绍
次氯酸(HClO)是一种活性氧(ROS)，它与多种生理和病理过程有关，如病原体反应、抗炎症调节、衰老。次氯酸通常是由细胞中的髓过氧化物酶(MPO)催化的氯离子的过氧化反应产生的。由于次氯酸的pKa为7.59，其在生理pH条件下会部分解离成次氯酸根(ClO-)。维持适当水平的HClO/ClO-对于细胞正常的功能具有重要意义，而细胞内过量的HClO/ClO-则被认为与多种疾病相关，如关节炎、动脉粥样硬化、神经退行性病变、癌症。线粒体是细胞中一种能够提供能量的细胞器，在各种重要的生命进程中起着重要的作用。作为细胞氧的主要消耗者，线粒体是细胞活性氧物质(ROS)的主要来源，活性氧物质的积累可导致细胞死亡和各种疾病。作为线粒体中的一种活性氧，HClO/ClO-可诱导线粒体通透性，诱导细胞凋亡。因此，开发能够检测线粒体中HClO/ClO-的有效方法显得尤为重要。荧光分子探针具有高灵敏度、高时空分辨率、无损伤样品制备以及原位实时快速检测等优点，已成为是生命体内相关物质检测的有效工具，并被进一步应用于细胞器内分析物的检测，取得了令人满意的结果。近年来，科研工作者报道了大量的HClO/ClO-荧光探针，其中一些荧光探针被成功地应用于线粒体中HClO/ClO-的实时检测和成像。然而，这些荧光探针大多是基于单光子荧光成像技术设计的。由于它们的激发波长较短，其在体内的实际应用性能受到了限制，会导致背景荧光干扰严重、对生物样品的光毒性大、荧光团光漂白严重等问题。而双光子荧光成像技术利用两个能量较低的光子来获得荧光团的激发态，因此显示出比单光子荧光成像技术更大的优势，譬如较小的背景荧光干扰、对生物样品较低的光学毒性、更好的三维空间定位能力、更深的穿透深度、更低的自吸收。近年来，为了解线粒体中HClO/ClO-的生物学作用，科研人员已经开发了几种用于线粒体中HClO/ClO-的双光子荧光探针。然而，这些双光子荧光探针只能解决单光子探针的短激发波长的问题(采用近红外区域的双光子激发)，它们仍然存在发射波长位于短波长区域(<550nm)的缺陷，这仍然会导致背景荧光干扰和较低组织穿透深度等问题。这些双光子荧光探针的短波长发射，使得它们在生物成像中的优势被削弱，因为一些生物分子(如NADH、核黄素和叶酸等)也能被双光子激光激发，产生蓝绿色区域的背景荧光干扰。此外，上述双光子探针的短发射可被诸如血红蛋白(Hb)和氧合血红蛋白(HbO2)等生物分子吸收，这降低了深部组织成像中荧光信号的收集效率。因此，发展具有远红到近红外区发射特性的双光子探针具有重大意义，其发射光能够较少地被生物分子吸收，并且能够深入深层组织，从而进一步减小背景荧光的干扰，提高采集效率。然而，目前未见具有远红外到近红外发射的线粒体靶向的次氯酸根双光子荧光探针的报道。
技术实现思路
本专利技术针对目前次氯酸根双光子荧光探针所面临的问题和现状，提供了一种线粒体靶向的次氯酸根双光子荧光探针，该双光子荧光探针利用三苯基膦阳离子作为线粒体靶向定位基团，用于细胞线粒体内ClO-的成像，该荧光探针具有远红到近红外区的发射、灵敏度高、选择性好及响应迅速等特点。本专利技术还提供了上述线粒体靶向的次氯酸根双光子荧光探针的制备方法及其在选择性检测水环境、生物细胞体系或小鼠组织中次氯酸根的应用。本专利技术为解决上述技术问题采用如下技术方案，一种线粒体靶向的次氯酸根双光子荧光探针，其特征在于该双光子荧光探针的结构式如下：本专利技术所述的线粒体靶向的次氯酸根双光子荧光探针的制备方法，其特征在于具体步骤为：步骤S1：将325mg6-氨基-1,2,3,4-四氢-1-萘酮、430mg碘甲烷、830mg碳酸钾与5mLDMF加入至干燥的250mL圆底烧瓶中，于45℃搅拌反应过夜，再将反应液冷却至室温，加入50mL水，将溶液用100mL乙酸乙酯萃取，收集有机相，将有机相用水洗涤后继续用饱和NaCl水溶液洗涤，用无水硫酸钠干燥后旋干溶剂得到粗产品，将粗产品用硅胶柱纯化得到白色固体化合物1160mg，产率为42％，所用洗脱剂体积配比为石油醚/乙酸乙酯＝3:1，其合成路线如下：步骤S2：在冰水浴的条件下，将189mg化合物1、313mg4-二乙氨基酮酸和15mL浓硫酸加入至50mL圆底烧瓶中，反应1小时后转移至油浴锅中加热至100℃反应4小时，将反应液冷却至室温，倒入冰水混合物中，加入2mL高氯酸，将析出沉淀的反应液抽滤并用冷水冲洗滤饼，将滤饼用二氯甲烷溶解，再用水洗涤后继续用饱和NaCl水溶液洗涤，无水硫酸钠干燥后减压旋干溶剂得到粗产品，将粗产品用硅胶柱纯化得到化合物2490mg，产率为86％，所用洗脱剂体积配比为二氯甲烷/甲醇＝15:1，其合成路线如下：步骤S3：将339mg化合物2、312mgPyBOP和20mL二氯甲烷加入100mL圆底烧瓶中，然后将1mL质量浓度为85％的水合肼加入到圆底烧瓶中，将反应液在室温下反应3小时，随后将反应液用水洗涤后继续用饱和NaCl水溶液洗涤，无水硫酸钠干燥后减压蒸馏除去二氯甲烷相得到粗产物，将粗产物用硅胶柱纯化得到化合物3246mg，产率为85％，所用洗脱剂体积配比二氯甲烷/乙酸乙酯＝10:1，其合成路线如下：步骤S4：在冰水浴的条件下，将200mg化合物3、30mL二氯甲烷和45μL三乙胺加入至100mL的圆底烧瓶中，随后向圆底烧瓶中滴加25μL溴乙酰氯，将反应液在室温下反应1小时，再将反应液减压蒸馏除去二氯甲烷得到化合物4的粗产物，将粗产物用硅胶柱柱层析纯化得到化合物4136.8mg，产率为68.4％，其合成路线如下：步骤S5：将140mg化合物4、280mg三苯基膦和20mL乙腈倒入50mL的圆底烧瓶中，于90℃回流反应24小时，将反应液冷却后减压除去溶剂得到粗产物，将粗产物用硅胶柱柱层析纯化得到目标产物双光子荧光探针Mito-TP-ClO90.1mg，产率为40.7％，其合成路线如下：本专利技术所述的线粒体靶向的次氯酸根双光子荧光探针在选择性检测水环境、生物细胞体系或小鼠组织中次氯酸根的应用，其中检测包括水溶液中荧光检测、细胞成像检测、组织成像检测。本专利技术与现有技术相比具有以下有益效果：(1)该双光子荧光探针的合成相对比较容易，且后处理过程相对简单；(2)该双光子荧光探针实现了次氯酸根离子高选择性高灵敏度快速检测，具有抵抗生命体内其它分子干扰的能力；(3)该双光子荧光探针具有近优异的线粒体靶向能力，双光子激发的远红到近红外区的发射，能够应用于组织中次氯酸根的成像检测。该双光子荧光探针通过降低生命体内自发荧光背景干扰、降低对生物样品的光损伤、提高组织穿透深度等特点，以获得更加准确及稳定的光学信号及成像效果。因此，本专利技术中的双光子荧光探针在次氯酸根检测领域具有广阔的应用前景，对次氯酸根在生物体生理和病理过程的作用机制的研究具有重要意义。附图说明图1是实施例1制得的荧光探针化合物Mito-TP-ClO在加入不同浓度次氯酸根后的紫外可见吸收光谱图；图2是实施例1制得的荧光探针化合物Mito-TP-ClO在加入不同浓度次氯酸本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种线粒体靶向的次氯酸根双光子荧光探针，其特征在于该双光子荧光探针的结构式如下：

【技术特征摘要】
1.一种线粒体靶向的次氯酸根双光子荧光探针，其特征在于该双光子荧光探针的结构式如下：2.一种权利要求1所述的线粒体靶向的次氯酸根双光子荧光探针的制备方法，其特征在于具体步骤为：步骤S1：将325mg6-氨基-1,2,3,4-四氢-1-萘酮、430mg碘甲烷、830mg碳酸钾与5mLDMF加入至干燥的250mL圆底烧瓶中，于45℃搅拌反应过夜，再将反应液冷却至室温，加入50mL水，将溶液用100mL乙酸乙酯萃取，收集有机相，将有机相用水洗涤后继续用饱和NaCl水溶液洗涤，用无水硫酸钠干燥后旋干溶剂得到粗产品，将粗产品用硅胶柱纯化得到白色固体化合物1160mg，产率为42％，所用洗脱剂体积配比为石油醚/乙酸乙酯＝3:1，其合成路线如下：步骤S2：在冰水浴的条件下，将189mg化合物1、313mg4-二乙氨基酮酸和15mL浓硫酸加入至50mL圆底烧瓶中，反应1小时后转移至油浴锅中加热至100℃反应4小时，将反应液冷却至室温，倒入冰水混合物中，加入2mL高氯酸，将析出沉淀的反应液抽滤并用冷水冲洗滤饼，将滤饼用二氯甲烷溶解，再用水洗涤后继续用饱和NaCl水溶液洗涤，无水硫酸钠干燥后减压旋干溶剂得到粗产品，将粗产品用硅胶柱纯化得到化合物2490mg，产率为86％，所用洗脱剂体积配比为二氯甲烷/甲醇＝15:1，其合成路线如下：步骤S3：将339...

【专利技术属性】
技术研发人员：毛国江，高广琦，王盈盈，梁珍珍，
申请(专利权)人：河南师范大学，
类型：发明
国别省市：河南,41