一种与南阳牛生长相关的CNV标记的检测方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种与南阳牛生长相关的CNV标记的检测方法及其应用：所述的CNV标记是指南阳牛SSTR2基因的拷贝数变异，该检测方法是以南阳牛基因组DNA为模板，通过实时荧光定量PCR分别扩增南阳牛SSTR2基因CNV区域和内参基因RPP30部分片段，根据2

A Detection Method of CNV Markers Related to the Growth of Nanyang Cattle and Its Application

【技术实现步骤摘要】
一种与南阳牛生长相关的CNV标记的检测方法及其应用
本专利技术涉及家畜分子生物学检测领域，具体涉及与南阳牛生长性状相关的SSTR2基因CNV标记的检测方法与应用。
技术介绍
拷贝数变异(copynumbervariations，CNVs)是指基因组DNA中较大片段的缺失或重复现象。CNVs是基因组上一种亚显微水平的结构变异，涉及的片段大小在50bp到数个Mb之间，包括拷贝数增加(copynumbergain)和拷贝数减少(copynumberloss)。有些拷贝数变异并不对动植物的表型造成影响，而有些拷贝数变异则通过扰乱基因序列和改变基因含量来影响基因表达，从而造成表型差异和表型适应。目前应用于拷贝数变异检测的技术主要有：(1)比较基因组杂交(CGH)：CGH可在全部染色体或染色体亚带水平上，对不同基因组之间DNA序列的拷贝数进行检测，从而发现拷贝数变异。然而该技术分辨率在Mb水平，更小片段的拷贝数片段则不易检出。同时该技术操作繁琐，通量低、耗时长且成本昂贵，需要较为大量的模板DNA，不利于大范围的推广。(2)多重连接探针扩增技术(MLPA)：MLPA是2002年发展起来的一种拷贝数检测方法。该技术具有较准确的相对定量功能，但是该方法探针制备较为复杂，同时操作步骤繁琐，耗时长。并且采用毛细管电泳作为分析手段，通量较低、成本较高且属于开放式操作，易于造成PCR产物的污染。(3)高分辨熔解曲线分析(HRM)：HRM于2003年专利技术，其通过精确的变温速率控制以及DNA饱和染料的指示，实现了通过研究PCR产物序列的熔解温度而对PCR产物进行鉴定。该技术具有快速、廉价、高通量等优点，同时具有以下不足：该方法实现的前提是突变位点必须是杂合的，从而增加了实验的成本和设计的难度，而且降低了检测的通量。并且，单个核苷酸的差异对于熔解曲线的影响较小，甚至有些差异几乎不影响熔解曲线的偏移，造成检测灵敏度较低。(4)实时荧光定量PCR(qPCR)：根据所使用的荧光化学方法的不同，主要分为荧光染料嵌入法和荧光杂交探针法两类。PCR反应体系中加入过量的SYBRGreen染料分子，能特异性地渗入DNA双链并发射荧光信号，而游离的染料分子则仅有很低的荧光本底，几乎不发光，从而确保信号的增加与PCR产物的增加同步，可通过检测荧光信号的强度来反映基因组DNA的数量。通过对目的基因(具有拷贝数变异)及参考基因(无拷贝数变异)进行相对定量，根据2-ΔΔCt方法统计检测样本候选基因的拷贝数。荧光染料嵌入法的优点是实验成本低、无需设计合成探针、使用方便，可以检测目的片段的绝对拷贝数，但不适用于大样本的高通量检测。(5)SNP芯片：目前使用较少。(6)高通量测序技术：当前最有效的检测手段是通过重测序来检测基因组结构变异，但这种方法相较之前的方法成本较高。(7)杂交技术：主要包括Southernblotting杂交、荧光原位杂交(fluorescenceinsituhybridization,FISH)、多重扩增探针杂交技术(multiplexamplifiableprobehybridization,MAPH)等，但这些方法成本比较高，时间长而且不够准确，目前使用较少。分子育种，即分子标记辅助选择(molecularmark-assistselection，MAS)，该技术是借助DNA分子标记对遗传资源或育种材料进行选择，对畜禽的综合性状进行品种改良。在畜禽育种中，通过对与生长性状密切相关的DNA标记的选择，达到早期选种和提高育种值准确性的目的，从而在畜禽育种中获得更大的遗传进展。生长抑素受体2(SSTR2)属于跨膜G蛋白偶联受体(GPCRs)家族，并通过结合配体在细胞信号转导中发挥重要作用。生长抑素受体包括5名成员(SSTR1、SSTR2、SSTR3、SSTR4和SSTR5)。在生长抑素受体中，SSTR2主要在人的大脑皮层、垂体和肾上腺中表达，并通过对Wnt/β-catenin通路的负面调节，来发挥抑增殖和促凋亡的作用。牛SSTR2基因位于ch19:58716920-58723781(UMD_3.1.1)，具有1107bp编码序列，编码368个氨基酸。它落在重要的QTL上，如体细胞评分，乳脂产量，真胃移位，大理石花纹评分，分娩难易，阴囊周长和体重等等。目前，尚未见有关SSTR2基因CNV对南阳牛生长性状影响的文献报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种与南阳牛生长相关的CNV标记的检测方法及其应用。本专利技术可以为南阳牛分子育种提供理论依据，便于南阳牛生长性状的标记辅助选择，快速建立遗传资源优良的南阳牛种群。为了实现上述目的，本专利技术采用了以下技术方案：一种与南阳牛生长性状相关的CNV标记的检测方法，包括以下步骤：以南阳牛血液全基因组DNA为模板，以引物对P1和引物对P2为引物，通过实时荧光定量PCR分别扩增南阳牛SSTR2基因拷贝数变异区域和作为内参序列的RPP30基因部分片段，然后根据定量结果鉴定南阳牛SSTR2基因的拷贝数变异类型，所述的SSTR2基因拷贝数变异区域位于牛参考基因组序列chr19:58598786bp-59376845bp(Bos_taurus_UMD_3.1.1)。优选的，所述的拷贝数变异类型是根据2-ΔΔCt将定量结果分为的三类：增加型，2-ΔΔCt≥2.5；减少型，2-ΔΔCt<1.5；正常型，1.5≤2-ΔΔCt<2.5。优选的，所述的引物对P1为：上游引物F1：5′-CTCTTCGGTCTCAGTGGC-3′，下游引物R1：5′-CGGGATTTGTCCTGCTTA-3′；所述的引物对P2为：上游引物F2：5′-TGCTTCCATTGTTTCCTGATGA-3′，下游引物R2：5′-TGGGACCAGGTTCCATGATC-3′。优选的，所述的实时荧光定量PCR所用的扩增体系以13μL计为：50ng/μL模板DNA1μL、10pmol/L的引物对P1或引物对P2所对应的上、下游引物各0.5μL、2×SYBRGreenqPCRMix6.5μL，以及去离子水4.5μL。优选的，所述的实时荧光定量PCR所用的反应程序包括以下步骤：(1)预变性95℃30s；(2)扩增反应：95℃变性10s，60℃退火30s，39个循环。上述与南阳牛生长性状相关的CNV标记的检测方法在南阳牛分子标记辅助选择育种的应用。优选的，所述的SSTR2基因拷贝数变异区域的不同拷贝数变异类型与南阳牛的生长性状显著相关，其中，具有减少型拷贝数变异类型的个体在生长性状(例如，胸围、体重)上优于具有正常型和增加型拷贝数变异类型的个体，并且具有减少型拷贝数变异类型的个体的胸围显著高于正常型，表型较为优异，而正常型个体表型较差。一种检测与南阳牛生长性状相关的CNV标记的实时荧光定量PCR试剂盒，包括上述引物对P1及P2。本专利技术的有益效果体现在：本专利技术根据所发现的南阳牛SSTR2基因的拷贝数变异(CNV)位点(位于参考基因组序列chr19:58598786bp-59376845bp内，Bos_taurus_UMD_3.1.1)，建立了通过实时荧光定量PCR技术检测该位点在南阳牛群体中的拷贝数变异的方法，检测方法操作简便，可以快速、准确、可靠的获本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种与南阳牛生长性状相关的CNV标记的检测方法，其特征在于：包括以下步骤：以南阳牛基因组DNA为模板，通过实时荧光定量PCR分别扩增南阳牛SSTR2基因拷贝数变异区域和作为内参序列的RPP30基因部分片段，然后根据定量结果鉴定南阳牛SSTR2基因的拷贝数变异类型，所述的SSTR2基因拷贝数变异区域位于参考基因组序列chr19:58598786bp‑59376845bp。

【技术特征摘要】
1.一种与南阳牛生长性状相关的CNV标记的检测方法，其特征在于：包括以下步骤：以南阳牛基因组DNA为模板，通过实时荧光定量PCR分别扩增南阳牛SSTR2基因拷贝数变异区域和作为内参序列的RPP30基因部分片段，然后根据定量结果鉴定南阳牛SSTR2基因的拷贝数变异类型，所述的SSTR2基因拷贝数变异区域位于参考基因组序列chr19:58598786bp-59376845bp。2.如权利要求1所述一种与南阳牛生长性状相关的CNV标记的检测方法，其特征在于：所述的拷贝数变异类型是根据2-ΔΔCt将定量结果分为的三类：增加型，2-ΔΔCt≥2.5；减少型，2-ΔΔCt<1.5；正常型，1.5≤2-ΔΔCt<2.5。3.如权利要求1所述一种与南阳牛生长性状相关的CNV标记的检测方法，其特征在于：所述的SSTR2基因拷贝数变异区域的扩增引物对为：上游引物F1：5′-CTCTTCGGTCTCAGTGGC-3′，下游引物R1：5′-CGGGATTTGTCCTGCTTA-3′；所述的RPP30基因部分片段的扩增引物对为：上游引物F2：5′-TGCTTCCATTGTTTCCTGATGA-3′，下游引物R2：5′-TGGGACCAGGTTCCATGATC-3′。4.如权利要求1所述一种与南阳牛生长性状相关的CNV标记的检测方法，其特征在于：所述的实时荧光定量PCR的反应程序包括以下步骤：95℃预变性30s；95℃变性10s，60℃退火30s，共39个循环。5.如权利要求1...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈宏，程杰，曹修凯，黄永震，蓝贤勇，
申请(专利权)人：西北农林科技大学，
类型：发明
国别省市：陕西,61