模型及其构建方法技术

本发明专利技术提供了一套基于宏基因组测序的动脉粥样硬化早期识别模型构建技术。本发明专利技术采用国际先进的Illumina NovaSeq平台，对人的粪便和口腔菌群宏基因组DNA采用Nextera转座子鸟枪宏基因组测序技术，配合传统的高通量测序，并产生宏基因组数据。进而运用数据库和系统等进行宏基因组测序数据分析。通过对数据进行训练集和验证机矫正，并配合机器学习和神经网络算法，产生可靠的早期动脉粥样硬化识别模型，并通过扩大宏基因组生物标志物进行验证。本发明专利技术基于较大规模的系统性队列研究，通过队列将病程变化和菌谱进行关联性分析，从而对早期标记物进行判断，在预防医学领域提供了更具价值的系统性研究方法。

Model and its construction method

【技术实现步骤摘要】
模型及其构建方法
本专利技术涉及生物
，特别涉及模型及其构建方法。
技术介绍
心血管疾病作为全球范围的主要致死因素，其中动脉粥样硬化则占到了主要的发病因素。传统研究分析结果表明，动脉粥样硬化的危险相关因素涉及男性、年龄、吸烟、高血压、高脂血症、肥胖和糖尿病等慢性炎性疾病。另一方面，生物标志物如循环系统中高敏感性C反应蛋白的升高，也暗示了粥样硬化的病因。近年来越来越多的证据表明，感染和慢性炎性疾病，例如类风湿性关节炎，也与动脉粥样硬化风险增加有关。其中细菌感染造成的炎症机制目前被认为是导致动脉粥样硬化形成的重要原因。人体的微生物菌群主要位于肠道远端和口腔，其中下消化道含有近100万亿个微生物，其中大部分是细菌。目前在这个微生物群中已经鉴定出了1000多种细菌的种类和7000多个株，尤其是拟杆菌门和厚壁菌门占肠道微生物群中已知分类的90％以上。目前已知的微生物群的总编码基因超过了330万个，达到人类宿主基因组编码数的150多倍，其中许多微生物的产物对人体代谢和健康有重要影响。随着高通量测序技术的普及、人类微生物组计划的开展(HumanMicrobiomeProject)及医学大数据模型的建立，肠道、口腔和动脉硬化粥样斑块等微生物组和宏基因组在动脉粥样硬化形成中的作用逐步被揭示。人体微生物共生菌群也作为检测靶点和生物标记物，为精准医疗提供重要诊疗价值。Koren等人通过对15例患者和15例正常人的动脉粥样硬化斑块进行对比，并对牙菌斑及粪便进行16SrDNA测序，发现在所有的动脉粥样硬化斑块样品中均鉴定到了动脉粥样硬化的潜在标志物，即浅黄华丽单胞菌(Chryonomonas)。多数样本在粥样硬化斑块、粪便及口腔中均出现了韦荣球菌(Veillonella)和链球菌(Streptococcus)，且动脉粥样硬化斑块中的Veillonella和Streptococcus的综合丰度与口腔丰度相关。Mitra等人对颈动脉粥样硬化的研究表明，斑块组织中具有2％-16％的测序读段来自于细菌，其中鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusrhamnosus)和多糖奈瑟球菌(Neisseriapolysaccharea)等含量较高。具有缺血症状的病人斑块和无症状病人斑块菌群在碳水化合物和氨基酸能量代谢等基本通路上具有很大差异，提示病人菌群该方面的功能较差。Karlsson等人使用鸟枪法对12例动脉粥样硬化患者和13例正常人的肠道宏基因组进行测序，发现动脉粥样硬化患者中柯林斯氏菌(Collinsella)明显丰富，而健康对照组中的罗氏菌(Roseburia)和真杆菌(Eubacterium)更丰富。进一步对宏基因组的功能进行分析，研究人员揭示了患者的肠道微生物可以合成和消耗植烯脱氢酶，且相应的患者血清β-胡萝卜素水平也降低，且肠道微生物丰富程度和宿主炎症状态有关联，从而影响动脉粥样硬化的进程。最近Zhu等人通过对一个由8个素食者和10个杂食者构成的肠道菌群短期队列进行研究发现，肠道微生物可以由膳食中的营养物质如胆碱、卵磷脂和l-肉碱等产生TMAO(氧化三甲胺)，杂食主义比素食主义者的血液TMAO含量更高，并更易促进血栓的形成和发展。同时该研究提示使用低剂量的阿斯匹林来减轻TMAO升高所导致的血小板聚。根据上述消化道菌群和粥样硬化斑块相关研究，目前可将菌群影响动脉粥样化的形成归纳为三条路径(图1)：①病灶处或远端的感染造成炎症，并加剧斑块发展或触发斑块破裂；②肠道菌群使胆固醇和脂肪代谢失调会影响动脉粥样硬化斑块的发展；③被菌群代谢的饮食和特定营养成分可能会对动脉粥样硬化有不同影响，如已知膳食纤维是有益的，而细菌代谢产物三甲胺则被认为是有害。尽管当前关于宏基因组的研究已为粥样硬化的肠道菌群部分分子标记物和部分病因机理提供了一些重要的结论，但上述研究在设计和技术层面上存在诸多不足之处，尤其是缺乏准确的流行病学病因结论及可为发病早期诊断提供标记物的可靠数据。其原因和不足具体如下：1.目前的研究基本均针对西方人群，东方人群研究相对较少，且我国的宏基因组和心血管疾病研究也尚处于起步阶段；东西方人的遗传背景、免疫系统、生活习惯和饮食习惯具有较大差异，例如在受试者的饮食习惯方面，西方主要为高脂高热量饮食，而东方则以碳水化合物饮食为主；在天然状态下，东方人的肠道普雷氏菌含量就远高于西方人，而西方人则以拟杆菌含量占优。2.大多数研究采用了样本-对照(Case-Control)的研究思路，缺乏系统性队列研究的偏倚控制，受试者的背景相对复杂，且对既往饮食内容、生活习惯的调查缺失；另一方面，研究对象是已经产生疾病的病人消化道宏基因组，属于横断面研究，不能通过队列将病程变化和菌谱进行关联性分析，从而对早期标记物进行判断，在预防医学领域所提供的价值极其有限；再次，既往的宏基因组研究入组人数较少，通常只有20-50例样本，缺乏上百例甚至更多的受试者的较大规模研究，抽样则可能存在误差。3.技术层面的先进性问题。既往研究主要依靠细菌的16srDNA高变区的测序，仅能对生物中的细菌界进行研究，而对其他诸如病毒、真菌、寄生虫等微生物无能为力；和检验效能更为可靠的宏基因组鸟枪测序(Shotgun)方法相比，16srDNA测序只能知道微生物组中“谁在那儿”，而后者除此还可知道他们“在做什么”，这对解释临床表型和发病机理具有重要意义。4.受试者临床表型的丰富度问题，尤其是既往研究颅部影像学资料不足，仅靠判定有无粥样斑块或梗死病变，而未对其进行病理分类和定量，是导致该类研究结论单一的原因。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术提供了模型及其构建方法。本专利技术基于较大规模的系统性队列研究，通过队列将病程变化和菌谱进行关联性分析，从而对早期标记物进行判断，在预防医学领域提供了更具价值的系统性研究方法。为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：本专利技术提供了动脉粥样硬化的识别模型的构建方法，包括如下步骤：步骤1：获得待测样本的宏基因组DNA；步骤2：建库、测序，获得宏基因组数据；步骤3：所述宏基因组数据经分析，并经训练集和验证机矫正，再经机器学习，结合神经网络算法，获得动脉粥样硬化的识别模型。在本专利技术的一些具体实施方案中，步骤1中所述待测样本包括粪便或口腔分泌物。在本专利技术的一些具体实施方案中，所述口腔分泌物包括唾液或痰液。在本专利技术的一些具体实施方案中，步骤2中所述测序采用Nextera转座子鸟枪宏基因组测序和高通量16sV3-V4rDNA测序。在本专利技术的一些具体实施方案中，步骤3中所述分析采用QIIME2，Silva数据库，DIAMOND，NCBIBlastnr数据库或MEGAN系统中的一种或多种。在本专利技术的一些具体实施方案中，步骤3中所述分析包括质量控制、比对、距离矩阵计算、操作分类单元(OTU)划分、多样性分析、系统进化树构建和信号通路或差异菌群功能注释中的一种或多种。在本专利技术的一些具体实施方案中，步骤2中所述建库包括DNA碎片化反应；所述DNA碎片化反应的体系包括TagmentDNAbuffer(2x)、Amplicontagmentmix(Tn5)、宏基因组DNA和水。在本专利技术的一些具体实施方案中，所述建库还包括宏基因组DNA扩增；所述宏基因组DNA扩增的反应体系包括所本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.动脉粥样硬化的识别模型的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤1：获得待测样本的宏基因组DNA；步骤2：建库、测序，获得宏基因组数据；步骤3：所述宏基因组数据经分析，并经训练集和验证机矫正，再经机器学习，结合神经网络算法，获得动脉粥样硬化的识别模型。

【技术特征摘要】
1.动脉粥样硬化的识别模型的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤1：获得待测样本的宏基因组DNA；步骤2：建库、测序，获得宏基因组数据；步骤3：所述宏基因组数据经分析，并经训练集和验证机矫正，再经机器学习，结合神经网络算法，获得动脉粥样硬化的识别模型。2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤1中所述待测样本包括粪便或口腔分泌物。3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述口腔分泌物包括唾液或痰液。4.根据权利要求1至3任一项所述的构建方法，其特征在于，步骤2中所述测序采用Nextera转座子鸟枪宏基因组测序和高通量16sV3-V4rDNA测序。5.根据权利要求1至4任一项所述的构建方法，其特征在于，步骤3中所述分析采用QIIME2，Silva数据库，DIAMOND，NCBIBlastnr数据库或MEGAN系统中的一种或多种。6.根据权利要求1至5任一项所述的构建方法，其特征在于，步骤3中所述分析包括质量控制、比对、距离矩阵计算、操作分类单元(OTU)划分、多...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈兴栋，朱嗣博，庆涛，金力，
申请(专利权)人：复旦大学泰州健康科学研究院，
类型：发明
国别省市：江苏,32