分离植物抗菌肽的方法、植物抗菌肽和植物抗菌肽的用途技术

本发明专利技术提供分离植物抗菌肽的方法、植物抗菌肽和植物抗菌肽的用途，分离植物抗菌肽的方法包括以下步骤：取一定质量的黑芝麻，加醋酸溶液于黑芝麻中；将所述黑芝麻和醋酸溶液，在超声波发生仪中进行超声，过滤得提取液；将所述提取液水浴加热，然后降至室温；将所述提取液离心,弃沉淀，收获上清液；将所述上清液依次进行透析并浓缩，获得反相色谱样品；将所述反相色谱样品进行反相高效液相色谱分离，获得所述分离的植物抗菌肽。1.以黑芝麻为原料，直接提取，省掉了去皮去脂的繁琐工序，减少了有机试剂的应用，降低了操作难度，提高了生产效率，降低了生产成本，符合工业化生产。2.所制备的黑芝麻抗菌肽具有广谱抑菌作用，对白色念珠菌、铜铝假单胞杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、流感嗜血杆菌都具有很强的抑菌作用。可广泛应用于体外消杀产品和家禽家畜饲料添加剂等领域。

Separation of Plant Antimicrobial Peptides and Application of Plant Antimicrobial Peptides

【技术实现步骤摘要】
分离植物抗菌肽的方法、植物抗菌肽和植物抗菌肽的用途
本专利技术涉及生物制药领域，具体地，涉及分离植物抗菌肽的方法、植物抗菌肽和植物抗菌肽的用途。
技术介绍
抗菌肽是生物机体在抵御病原微生物的防御反应中所产生的一类抗微生物与一些恶性细胞的短肽。它是机体先天性免疫系统的重要组成部分，对细菌、真菌、寄生虫、病毒、肿瘤细胞等有着广泛的抑制作用。天然抗菌肽通常是由12-60个氨基酸组成的小分子阳离子多肽，由于富含赖氨酸、精氨酸和组氨酸等碱性氨基酸，抗菌肽通常带有2-7个正电荷，等电点大于7，表现出较强的阳离子特征。研究发现，动植物的免疫细胞，如吞噬细胞和粘膜上皮细胞，具有多种可以抑制微生物生长的抗菌肽存在，其作用机理首先是抗菌肽能够很好地与由两性分子构成、特别是呈电负性的细胞膜结合，这是抗菌肽与细胞膜发生相互作用的结构基础，阻止破坏细胞壁的合成与膜作用、在脂膜上形成孔洞，使重要的内容物外泄、与细胞内线粒体、核酸大分子等重要细胞器相互作用，最终导致菌体死亡。目前，从动植物分离得到的抗菌肽种类多样，分布广泛，在昆虫、鱼类、哺乳动物、两栖动物和植物等生物中均有发现。对于不同来源的抗菌肽的应用性尚未有系统的研究。特别是植物抗菌肽，尤其不稳定，易被蛋白水解酶水解，从而大大降低其抗菌活性。因而，关于植物抗菌肽的研究还有待深入。
技术实现思路
本专利技术旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本专利技术的一个目的在于提出一种能够有效抑制细菌与真菌增殖的手段。本专利技术的第一方面，本专利技术提供一种分离的植物抗菌肽。根据本专利技术的实施例，本专利技术的分离的植物抗菌肽能有有效抑制细菌与真菌的生长，进而能够预防或治疗微生物感染性疾病。本专利技术的第二方面，本专利技术提供了分离植物抗菌肽的方法，包括以下步骤：(1)取一定质量的黑芝麻，加醋酸溶液于黑芝麻中；(2)将所述黑芝麻和醋酸溶液，在超声波发生仪中进行超声，过滤得提取液；(3)将所述提取液水浴加热，然后降至室温；(4)将所述提取液离心,弃沉淀，收获上清液；(5)将所述上清液依次进行透析并浓缩，获得反相色谱样品；(6)将所述反相色谱样品进行反相高效液相色谱分离，获得所述分离的植物抗菌肽。所述步骤(1)中加入的所述醋酸溶液5-20倍于所述黑芝麻的体积，所述醋酸溶液的浓度为1-10％。所述超声时间为10-35min。所述步骤(3)中的所述水浴加热温度为60-100℃，时间为5-30min。所述步骤(4)中所述离心转速为8000-14000rpm,离心时间为5-20min。所述步骤(5)中的透析的时间为24-72小时。所述步骤(6)进一步包括以下步骤：A、将所述反相色谱样品进行反相高效液相色谱分离，其中所述反相色谱柱是反相C4硅胶柱；B、将所述样品上样至所述反相C4硅胶柱上，并依次利用含有三氟乙酸的双蒸水和含有三氟乙酸的乙腈对所述C4硅胶柱进行洗脱处理，获得洗脱样品；C、将所述洗脱样品浓缩，获得所述分离的植物抗菌肽。所述步骤(B)中的所述含有三氟乙酸双蒸水中三氟乙酸的含量为0.1％-0.5％，所述含有三氟乙酸的乙腈中三氟乙酸的含量为0.1％-0.5％，乙腈含量为75％-90％。所述步骤(B)中的洗脱处理时间为30-60分钟。所述步骤(1)中的将所述黑芝麻为100g；加5倍于黑芝麻体积的7％醋酸溶液500mL于黑芝麻中；所述步骤(2)中超声波发生仪功率为200W-300W，频率为40kHz中进行超声，提取时间为20min；所述步骤(3)中的所述水浴加热温度为80℃；所述步骤(4)中的离心条件为在10000rpm条件下4℃离心5min；所述步骤(5)中的透析的时间为48小时。所述步骤(B)中的所述含有三氟乙酸双蒸水中三氟乙酸的含量为0.1％，所述含有三氟乙酸的乙腈中三氟乙酸的含量为0.1％，乙腈含量为90％，所述步骤(B)中的洗脱处理时间为30分钟。由于植物种子为黑芝麻，分离的植物抗菌肽的产率较高。本专利技术的第三方面，利用本专利技术上述分离植物抗菌肽方法得到的植物抗菌肽，具有如下特征：PH值：利用酸度计测定抗菌肽的PH值为2.82；等电点:利用浊度法测定抗菌肽的PI值为9.4-10.2的碱性蛋白；分子量：利用SDS-PAGE电泳法和激光解析电离飞行时间质谱法，测得分子量为4-6kd。所述抗菌肽具有如下特征：称取样品1mL于水解瓶中,过甲酸处理后,加入1mL盐酸110℃水解22～24h,水解物采用UPLC方法测定氨基酸种类为：甘氨酸(Glycine)、半胱氨酸(Cysteine)、精氨酸(Argnine)、赖氨酸(Lysine)、组氨酸(Histidine)、丙氨酸(Alanine)、苏氨酸(Threonine)、天冬氨酸(Asparagine)、亮氨酸(Leucine)、酪氨酸(Tyrosine)、苯丙氨酸(Phenylephrine)、丝氨酸(Serine)、谷氨酸(Glutamicacid)、缬氨酸(Valine)。本专利技术的第四方面，本专利技术提供了上述分离植物抗菌肽方法得到的植物抗菌肽的用途，所述抗菌肽可用作预防和治疗微生物感染性疾病。本专利技术优点：1.以黑芝麻为原料，直接提取，省掉了去皮去脂的繁琐工序，减少了有机试剂的应用，降低了操作难度，提高了生产效率，降低了生产成本，符合工业化生产。2.所制备的黑芝麻抗菌肽具有广谱抑菌作用，对白色念珠菌、铜铝假单胞杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、流感嗜血杆菌都具有很强的抑菌作用。可广泛应用于体外消杀产品和家禽家畜饲料添加剂等领域。附图说明图1为实施例1-3中得到的植物抗菌肽对白色念珠菌抑菌的结果和阴性对照图。图2为1-3实施例中得到的植物抗菌肽对大肠杆菌抑菌的结果和阴性对照图。图3为实施例1-3中得到的植物抗菌肽对金黄色葡萄球菌抑菌的结果和阴性对照图。图4为实施例1-3中得到的植物抗菌肽对铜绿假单胞杆菌抑菌的结果和阴性对照图。图5为抗菌肽提取液对白色念珠菌和流感嗜血杆菌的抑菌率结果图。具体实施方式一种分离植物抗菌肽的方法，包括以下步骤：(1)取一定质量的黑芝麻，加醋酸溶液于黑芝麻中；(2)将黑芝麻和醋酸溶液，在超声波发生仪中进行超声，过滤得提取液；(3)将提取液水浴加热，然后降至室温；(4)将提取液离心,弃沉淀，收获上清液；(5)将上清液依次进行透析并浓缩，获得反相色谱样品；(6)将反相色谱样品进行反相高效液相色谱分离，获得分离的植物抗菌肽。步骤(1)中加入的醋酸溶液5-20倍于黑芝麻的体积，醋酸溶液的浓度为1-10％。超声时间为10-35min。步骤(3)中的水浴加热温度为60-100℃，时间为5-30min。步骤(4)中离心转速为8000-14000rpm,离心时间为5-20min。步骤(5)中的透析的时间为24-72小时。步骤(6)进一步包括以下步骤：A、将反相色谱样品进行反相高效液相色谱分离，其中反相色谱柱是反相C4硅胶柱；B、将样品上样至反相C4硅胶柱上，并依次利用含有三氟乙酸的双蒸水和含有三氟乙酸的乙腈对C4硅胶柱进行洗脱处理，获得洗脱样品；C、将洗脱样品浓缩，获得分离的植物抗菌肽。步骤(B)中的含有三氟乙酸双蒸水中三氟乙酸的含量为0.1％-0.5％，含有三氟乙酸的乙腈中三氟乙酸的含量为0.1％-0.5％，乙腈含量为75％-90％。步骤(B)中的洗脱处理本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.分离植物抗菌肽的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)取一定质量的黑芝麻，加醋酸溶液于黑芝麻中；(2)将所述黑芝麻和醋酸溶液，在超声波发生仪中进行超声，过滤得提取液；(3)将所述提取液水浴加热，然后降至室温；(4)将所述提取液离心,弃沉淀，收获上清液；(5)将所述上清液依次进行透析并浓缩，获得反相色谱样品；(6)将所述反相色谱样品进行反相高效液相色谱分离，获得所述分离的植物抗菌肽。

【技术特征摘要】
1.分离植物抗菌肽的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)取一定质量的黑芝麻，加醋酸溶液于黑芝麻中；(2)将所述黑芝麻和醋酸溶液，在超声波发生仪中进行超声，过滤得提取液；(3)将所述提取液水浴加热，然后降至室温；(4)将所述提取液离心,弃沉淀，收获上清液；(5)将所述上清液依次进行透析并浓缩，获得反相色谱样品；(6)将所述反相色谱样品进行反相高效液相色谱分离，获得所述分离的植物抗菌肽。2.如权利要求1所述的分离植物抗菌肽的方法，其特征在于，所述步骤(1)中加入的所述醋酸溶液5-20倍于所述黑芝麻的体积，所述醋酸溶液的浓度为1-10％。3.如权利要求1所述的分离植物抗菌肽的方法，其特征在于，所述超声时间为10-35min。4.如权利要求1所述的分离植物抗菌肽的方法，其特征在于，所述步骤(3)中的所述水浴加热温度为60-100℃，时间为5-30min。5.如权利要求1所述的分离植物抗菌肽的方法，其特征在于，所述步骤(4)中所述离心转速为8000-14000rpm,离心时间为5-20min。6.如权利要求1所述的分离植物抗菌肽的方法，其特征在于，所述步骤(5)中的透析的时间为24-72小时。7.如权利要求1所述的分离植物抗菌肽的方法，其特征在于，所述步骤(6)进一步包括以下步骤：A、将所述反相色谱样品进行反相高效液相色谱分离，其中所述反相色谱柱是反相C4硅胶柱；B、将所述样品上样至所述反相C4硅胶柱上，并依次利用含有三氟乙酸的双蒸水和含有三氟乙酸的乙腈对所述C4硅胶柱进行洗脱处理，获得洗脱样品；C、将所述洗脱样品浓缩，获得所述分离的植物抗菌肽。8.如权利要求6所述的分离植物抗菌肽的方法，其特征在于，所述步骤(B)中的所述含有三氟乙酸双蒸水中三氟乙酸的含量为0.1％-0.5％，所述含有三氟乙酸的乙腈中三氟乙酸的含量为0.1％-0.5％，乙腈含量为75％-90％。9.如权利要求7所述的分离植物抗菌肽的方法，其特征在于，所述步...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐阳，王紫嫣，王国强，董兵，齐达，王放，
申请(专利权)人：吉林省诚仁达医疗技术发展有限公司，
类型：发明
国别省市：吉林,22