一种检测H5N8亚型禽流感病毒神经氨酸酶的双抗夹心-酶联免疫吸附试剂盒制造技术

本发明专利技术提供一种检测H5N8亚型禽流感病毒神经氨酸酶双抗夹心‑酶联免疫吸附试剂盒，包括预包被H5N8神经氨酸酶特异性单克隆抗体的96孔酶标板、阳性品、阴性品、辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗体、样品稀释液、浓缩洗涤液、显色液和终止液；将H5N8亚型禽流感病毒神经氨酸酶基因片段克隆、重组表达、纯化复性后获得神经氨酸酶N8蛋白免疫抗原，利用生物信息学软件预测H5N8亚型禽流感病毒的神经氨酸酶抗原表位，人工合成相应多肽后将其预包被至酶标板，采用多肽‑酶联免疫吸附(ELISA)模式，筛选杂交瘤中的神经氨酸酶特异性抗体，多肽‑ELISA检测体系获得稳定的多个位点杂交瘤细胞株及单抗，构建双抗夹心N8蛋白‑ELISA检测体系检测试剂盒。

A Double Antibody Sandwich-ELISA Kit for Detecting Neuraminidase of H5N8 Subtype Avian Influenza Virus

【技术实现步骤摘要】
一种检测H5N8亚型禽流感病毒神经氨酸酶的双抗夹心-酶联免疫吸附试剂盒
本专利技术涉及生物检测试剂盒
，特别是用于检测H5N8亚型禽流感病毒神经氨酸酶(N8)特异性位点的夹心-酶联免疫吸附(ELISA)试剂盒。
技术介绍
禽流感病毒是A型流感病毒属的负链RNA病毒，根据血凝素(Hemagglutinin，HA)和神经氨酸酶(Neuraminidase，NA)的抗原性差异可分成不同亚型，HA有16种抗原型，NA有9种抗原型，不同的HA和NA组成不同的流感病毒亚型。NA是一种糖蛋白，构成病毒囊膜纤突的重要成分，能够水解糖末端的唾液酸残基，使病毒颗粒从宿主细胞受体上释放。目前已确认可感染人的禽流感病毒亚型有H5N1、H9N2、H7N7、H7N2、H7N3、H5N2、H5N8、H10N7和H6N1，其中以H5N1最为常见。新型H5N8是2013年爆发的能感染人类的禽流感病毒亚型,人感染后主要表现为流感样症状，进而发展为肺炎和急性呼吸窘迫综合征等重症，患者重症比例高，致死率可达29％，因此引起了社会各界的广泛关注。研制有效的检测试剂和疫苗对H5N8亚型禽流感病毒的防控具有重要意义。目前，H5N8的检测多采用临床诊断与实验室诊断相结合的方法来进行，实验室诊断以反转录聚合酶链反应技术(RT-PCR)为主，所需仪器价格昂贵，并且对操作者要求较高。ELISA诊断方法具备高敏感性和特异性、检测方便易行、自动化程度高，而且价格低廉等诸多优点，已成为一种常用的检测方法。神经氨酸酶作为H5N8禽流感病毒第二个重要的表面抗原，是理想的检测靶标。因此本领域建立一种快速、简便、灵敏度高、特异性强、成本低的检测H5N8禽流感病毒特异性抗原的试剂盒具有重要的应用价值。
技术实现思路
本专利技术目的是利用双抗夹心-酶联免疫吸附试验的模式，提供一种快速、简便、灵敏度高、特异性强的检测H5N8亚型禽流感病毒神经氨酸酶的试剂盒，用于禽流感病毒的快速检测和流行病学研究。本专利技术涉及一种特异性检测H5N8亚型禽流感病毒神经氨酸酶的双抗夹心-酶联免疫吸附试剂盒，包括以H5N8亚型禽流感病毒神经氨酸酶N8重组蛋白为免疫原，表位多肽1-KIITIGSISLGLVVFNVLLHAVSIILTVLAL、2-DSKAVAVVHYGGVPTDVVN、3-NRPVLVISPDLSYRIGYLCAGLPS、4-GSFTLPVELSGRECLVPCFWV为筛选抗原，获得各表位特异性单克隆抗体，组建成功配对夹心抗体对；包括预包被特异性抗原表位1单抗的96孔酶标板、N8阳性样品、阴性对照、辣根过氧化物酶标记抗原表位4抗体、样品稀释液、浓缩洗涤液、显色液和终止液；特异性抗原表位1单抗，用包被液稀释浓度至5微克/毫升后包被于96孔酶标板，100微升/孔，4℃反应过夜后洗板3次；每孔加入200微升含1％牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液进行封闭，37℃孵育2小时后洗板3次，晾干，即为试剂盒中预包被抗体的酶标板；取待测样品加入包被孔，分别以N8重组蛋白作为阳性对照、阴性血清作为阴性对照，37℃孵育1小时后洗板5次；每孔加入100微升1：5000稀释的HRP-特异性抗原表位4IgG，37℃孵育1小时，洗板5次；每孔加入100微升显色液，37℃暗反应15分钟；每孔加入50微升终止液，震荡混匀，用酶标仪测定492纳米的吸光度值，以阴性对照孔的平均吸光度值的2.1倍为阈值判定阴阳性。本专利技术提供的重组禽流感病毒H5N8亚型神经氨酸酶抗原以神经氨酸酶核酸为模板，通过反转录聚合酶链式反应扩增获得血凝素基因，将该基因克隆于大肠杆菌原核表达载体并转化入宿主细胞后，用异丙基-b-d-硫代半乳糖苷诱导表达并纯化获得神经氨酸酶蛋白抗原。本专利技术提供的检测H5N8亚型禽流感病毒神经氨酸酶的双抗夹心-酶联免疫吸附试剂盒，酶标板分别预先包被5微克/毫升的N8特异性抗原表位1单抗，包被液为碳酸盐缓冲液，然后用1％的牛血清白蛋白(BSA)磷酸盐缓冲液进行封闭、晾干备用。本专利技术提供的检测H5N8亚型禽流感病毒神经氨酸酶双抗夹心-酶联免疫吸附试剂盒，阳性样品是序列明确的重组H5N8蛋白，阴性血清是未被H5N8感染的正常人血清。本专利技术提供的检测H5N8亚型禽流感病毒神经氨酸酶双抗夹心-酶联免疫吸附试剂盒，试剂盒应保存在-4℃，避免溶剂的反复冻融，同时显色液应避光保存。本专利技术提供的检测H5N8亚型禽流感病毒神经氨酸酶的双抗夹心-酶联免疫吸附试剂盒，能够特异性地识别样本中的H5N8神经氨酸酶特异性抗原位点。进一步方案为：重组禽流感病毒H5N8亚型神经氨酸酶抗原，禽流感病毒H5N8亚型的神经氨酸酶核酸为模板，通过反转录聚合酶链式反应扩增获得神经氨酸酶基因，将该基因克隆于大肠杆菌原核表达载体并转化入宿主细胞后，用异丙基-b-d-硫代半乳糖苷诱导表达并纯化获得神经氨酸酶蛋白抗原。进一步方案为：所述酶标板分别预先包被5微克/毫升H5N8神经氨酸酶抗原表位1单抗作为捕获抗体，包被液为碳酸盐缓冲液，然后用1％的牛血清白蛋白磷酸盐缓冲液进行封闭、晾干备用。进一步方案为：所述夹心抗体为5000稀释的HRP-特异性抗原表位4IgG。进一步方案为：所述阳性样品是序列明确重组的H5N8神经氨酸酶蛋白，阴性血清是未被H5N8感染的正常人血清。进一步方案为：所述试剂盒应保存在4℃，避免溶剂的反复冻融，同时显色液应避光保存。进一步方案为：所述试剂盒能够特异性地识别样本中的H5N8神经氨酸酶特异性抗原位点。本专利技术的优点及积极效果：(1)本专利技术首次提供H5N8亚型禽流感病毒神经氨酸酶双抗夹心-ELISA检测方法；(2)本专利技术试剂盒的捕获抗体、夹心HRP标记抗体均为鼠源杂交瘤单克隆腹水，容易大量获取并且纯度高；(3)本专利技术试剂盒表位1、表位4单克隆抗体特异性、亲和力高，能够有效配对识别H5N8神经氨酸酶，快速检测H5N8感染；(4)本专利技术试剂盒具有成本低、操作简便、速度快、灵敏度高、特异性强等优点，能够被基层单位广泛使用。附图说明图1为流感病毒示意图；图2为本专利技术的H5N8禽流感病毒神经氨酸酶双抗夹心-酶联免疫吸附检测试剂盒的制备工艺流程图；图3为本专利技术的H5N8禽流感病毒株的神经氨酸酶基因测序结果；图4为本专利技术的H5N8禽流感病毒株的神经氨酸酶重组蛋白表达SDS-PAGE电泳鉴定结果；图5为本专利技术的H5N8禽流感病毒株的神经氨酸酶氨基酸序列的抗原性、亲水性和表面可及性分析结果；图6为本专利技术的H5N8禽流感病毒株的神经氨酸酶抗体免疫印迹实验鉴定结果。具体实施方式以下实施例用来解释说明本专利技术，而不是对本专利技术进行限制，在本专利技术的精神和权利要求的保护范围内，对本专利技术作出的任何修改和改变，都落入本专利技术的保护范围。如图1至图6所示，本专利技术涉及一种特异性检测H5N8亚型禽流感病毒神经氨酸酶的双抗夹心-酶联免疫吸附试剂盒，流程工艺(见附图2)包括以H5N8亚型禽流感病毒神经氨酸酶N8重组蛋白为免疫原，表位多肽1-KIITIGSISLGLVVFNVLLHAVSIILTVLAL、2-DSKAVAVVHYGGVPTDVVN、3-NRPVLVISPDLSYRIGYLCAGLPS、4-GSFTLPVELSGRECLVPCFWV为筛选抗原，获得各表位特异性单克隆抗体，组建成功配对夹心抗本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测H5N8亚型禽流感病毒神经氨酸酶的双抗夹心‑酶联免疫吸附试剂盒，其特征在于：以H5N8亚型禽流感病毒神经氨酸酶N8重组蛋白为免疫原，表位多肽1‑KIITIGSISLGLVVFNVLLHAVSIILTVLAL、2‑DSKAVAVVHYGGVPTDVVN、3‑NRPVLVISPDLSYRIGYLCAGLPS、4‑GSFTLPVELSGRECLVPCFWV为筛选抗原，获得各表位特异性单克隆抗体，筛选配对夹心抗体对；包括预包被特异性抗原表位1单抗的96孔酶标板、N8阳性样品、阴性对照、辣根过氧化物酶标记抗原表位4抗体、样品稀释液、浓缩洗涤液、显色液和终止液；所特异性抗原表位1单抗，用包被液稀释浓度至5微克/毫升后包被于96孔酶标板，100微升/孔，4℃反应过夜后洗板3次；每孔加入200微升含1％牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液进行封闭，37℃孵育2小时后洗板3次，晾干，即为试剂盒中预包被抗体的酶标板；取待测样品加入包被孔，分别以N8重组蛋白作为阳性对照、阴性血清作为阴性对照，37℃孵育1小时后洗板5次；每孔加入100微升1：5000稀释的HRP‑特异性抗原表位4 IgG，37℃孵育1小时，洗板5次；每孔加入100微升显色液，37℃暗反应15分钟；每孔加入50微升终止液，震荡混匀，用酶标仪测定492纳米的吸光度值，以阴性对照孔的平均吸光度值的2.1倍为阈值判定阴阳性。...

【技术特征摘要】
1.一种检测H5N8亚型禽流感病毒神经氨酸酶的双抗夹心-酶联免疫吸附试剂盒，其特征在于：以H5N8亚型禽流感病毒神经氨酸酶N8重组蛋白为免疫原，表位多肽1-KIITIGSISLGLVVFNVLLHAVSIILTVLAL、2-DSKAVAVVHYGGVPTDVVN、3-NRPVLVISPDLSYRIGYLCAGLPS、4-GSFTLPVELSGRECLVPCFWV为筛选抗原，获得各表位特异性单克隆抗体，筛选配对夹心抗体对；包括预包被特异性抗原表位1单抗的96孔酶标板、N8阳性样品、阴性对照、辣根过氧化物酶标记抗原表位4抗体、样品稀释液、浓缩洗涤液、显色液和终止液；所特异性抗原表位1单抗，用包被液稀释浓度至5微克/毫升后包被于96孔酶标板，100微升/孔，4℃反应过夜后洗板3次；每孔加入200微升含1％牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液进行封闭，37℃孵育2小时后洗板3次，晾干，即为试剂盒中预包被抗体的酶标板；取待测样品加入包被孔，分别以N8重组蛋白作为阳性对照、阴性血清作为阴性对照，37℃孵育1小时后洗板5次；每孔加入100微升1：5000稀释的HRP-特异性抗原表位4IgG，37℃孵育1小时，洗板5次；每孔加入100微升显色液，37℃暗反应15分钟；每孔加入50微升终止液，震荡混匀，用酶标仪测定492纳米的吸光度值，以阴性对照孔的平均吸光度值的2.1倍为阈值判定阴阳性。2.如权利要求1所述的检测H5N8亚型禽流感病毒神经氨酸酶的双抗夹心-酶联...

【专利技术属性】
技术研发人员：张立兵，秦智锋，
申请(专利权)人：深圳贝安基因生物科技有限公司，深圳市检验检疫科学研究院，
类型：发明
国别省市：广东,44