用于治疗和/或预防心力衰竭的心肌干细胞的制造方法技术

本发明专利技术的目的在于提供能够长期维持心力衰竭的治疗和/或预防效果的新的移植用心肌干细胞、制造该细胞的方法和包含该细胞的细胞制剂。本发明专利技术涉及用于治疗和/或预防心力衰竭的心肌干细胞的制造方法、利用该制造方法制造的细胞和包含该细胞的细胞制剂、以及用于制造该细胞的脂质体，该制造方法包括将线粒体靶向载体与线粒体活化剂的复合物导入到心肌干细胞中的步骤。根据本发明专利技术，可提供能够长期维持由细胞移植带来的治疗和/或预防效果的心肌干细胞。

Manufacture of cardiac stem cells for the treatment and/or prevention of heart failure

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于治疗和/或预防心力衰竭的心肌干细胞的制造方法
本专利技术涉及用于治疗和/或预防心力衰竭的新的心肌干细胞的制造方法、包含线粒体被活化的心肌干细胞的细胞群、包含该心肌干细胞或细胞群的用于治疗和/或预防心力衰竭的细胞制剂、以及用于制造该心肌干细胞的脂质体。
技术介绍
心力衰竭是指由心肌梗塞、心肌病或心绞痛等心脏相关疾病、或者高血压、肾脏疾病或针对恶性肿瘤的化学疗法的副作用等心脏以外的疾病导致的、心脏的功能降低而无法向肺和全身供给必要量的血液的症状。心力衰竭在日本是仅次于癌症的主要死因，作为其根本性的治疗方法，可以列举心脏移植。但是，心脏移植存在移植供体的慢性不足、移植器官的耐用年限、排斥反应、终生服用免疫抑制剂、频繁的入院导管检查等涉及多方面的问题。自21世纪00年代后半期提出细胞移植作为针对心力衰竭的有希望的治疗方法以来，对使用包括iPS细胞的各种细胞的细胞移植疗法进行了研究。特别是心肌干细胞移植，由于是使用自体细胞的移植，因此具有能够使用在免疫学上安全、侵袭性低的方法进行等优点。心肌干细胞移植在临床试验中已被验证具有一定的效果(例如非专利文献1、非专利文献2、非专利文献3)。作为心肌干细胞移植的问题，可以列举例如在猪缺血再灌注模型中的心肌干细胞移植实验中移植细胞成活效果有限(非专利文献4)；在大鼠多柔比星心肌病模型中的心肌干细胞移植实验中存活率改善效果有限(非专利文献5)；等等。即，治疗效果的长期维持是今后心肌干细胞移植中的课题之一。现有技术文献非专利文献非专利文献1：Bolli,R.etal.,Lancet2011,378,pp.1847-1857非专利文献2：Makkar,R.R.etal.,Lancet2012,379,pp.895-904非专利文献3：Ishigami,S.etal.,Circulationresearch2015,116,pp.653-664非专利文献4：Takehara,N.etal.,J.Am.Coll.Cardiol.2008,52,pp.1858-65非专利文献5：DeAngelis,A.etal.,Circulation2010,121,pp.276-292
技术实现思路
专利技术所要解决的问题本专利技术的目的在于提供能够长期维持治疗和/或预防心力衰竭的效果的新的移植用心肌干细胞、制造该细胞的方法和包含该细胞的细胞制剂。用于解决问题的方法本专利技术人发现，通过将线粒体活化剂递送至心肌干细胞的线粒体，能够制造成活效果提高、可长期维持治疗效果的移植用细胞，从而完成了下述各专利技术。(1)一种用于治疗和/或预防心力衰竭的心肌干细胞的制造方法，其包括将线粒体靶向载体与线粒体活化剂的复合物导入到心肌干细胞中的步骤。(2)如(1)所述的制造方法，其中，上述复合物为包封有线粒体活化剂的线粒体靶向脂质体。(3)如(1)或(2)所述的制造方法，其中，上述复合物为包封有线粒体活化剂、含有二油酰磷脂酰乙醇胺以及磷脂酸和/或鞘磷脂作为脂质膜的构成脂质、并且在脂质膜表面上具有线粒体靶向分子的线粒体靶向脂质体。(4)如(3)所述的制造方法，其中，线粒体靶向分子为由序列号1中记载的氨基酸序列构成的肽。(5)如(1)至(4)中任一项所述的制造方法，其中，线粒体活化剂为白藜芦醇。(6)一种心肌干细胞，其通过将线粒体靶向载体与线粒体活化剂的复合物导入到心肌干细胞中而制造。(7)如(6)所述的心肌干细胞，其中，上述复合物为包封有线粒体活化剂的线粒体靶向脂质体。(8)如(6)或(7)所述的心肌干细胞，其中，上述复合物为包封有线粒体活化剂、含有二油酰磷脂酰乙醇胺以及磷脂酸和/或鞘磷脂作为脂质膜的构成脂质、并且在脂质膜表面上具有线粒体靶向分子的线粒体靶向脂质体。(9)如(8)所述的心肌干细胞，其中，线粒体靶向分子为由序列号1中记载的氨基酸序列构成的肽。(10)如(6)至(9)中任一项所述的心肌干细胞，其中，线粒体活化剂为白藜芦醇。(11)一种包含心肌干细胞的细胞群，其在利用荧光染料JC-1染色时JC-1二聚体的荧光强度相对于JC-1单体的荧光强度之比的平均值为1～4。(12)一种用于治疗和/或预防心力衰竭的细胞制剂，其包含(6)至(11)中任一项所述的心肌干细胞或细胞群。(13)一种用于向心肌干细胞的线粒体中导入被包封物的脂质体，其含有二油酰磷脂酰乙醇胺以及磷脂酸和/或鞘磷脂作为脂质膜的构成脂质，并且在脂质膜表面具有线粒体靶向分子。(14)如(13)所述的脂质体，其中，线粒体靶向分子为由序列号1中记载的氨基酸序列构成的肽。专利技术效果根据本专利技术，可提供能够长期维持由细胞移植带来的治疗和/或预防效果的心肌干细胞。该心肌干细胞能够用于对心肌损伤的治疗和/或预防、心脏功能的恢复、保护或降低抑制、或者心力衰竭的治疗和/或预防等。附图说明图1是示出导入了包封有白藜芦醇并用NBD进行了荧光标记的线粒体靶向脂质体的心肌干细胞的流式细胞术的直方图。横轴表示NBD的荧光量、纵轴表示细胞数。图2是使用共聚焦激光扫描型显微镜(CLSM)对导入了包封有白藜芦醇并用NBD进行了荧光标记的线粒体靶向脂质体的心肌干细胞进行观察的照片。图中，B照片表示用NBD(绿色)染色的RES-MITO-Porter、C照片表示用MTDR(红色)染色的线粒体、D照片表示用Hoechst33342(蓝色)染色的细胞核、A照片表示将B～D照片重叠后得到的照片。各图的比例尺为20μm。图3是示出将心肌成肌细胞与导入了包封有白藜芦醇的线粒体靶向脂质体的心肌干细胞(MA-细胞)或未处理的心肌干细胞(CPC)共培养时，在由多柔比星(终浓度10μg/mL、50μg/mL)所致的细胞损伤下的细胞存活率的图。图中，“共培养”表示心肌成肌细胞与MA-细胞的共培养、“CPC单独”表示心肌成肌细胞与CPC的共培养、“对照”表示心肌成肌细胞的单独培养。图4示出将心肌成肌细胞与导入了包封有白藜芦醇的线粒体靶向脂质体的心肌干细胞(MA-细胞(+RES-MITO-Porter))、导入了空的MITO-Porter的心肌干细胞(CPC(+MITO-Porter))、用白藜芦醇直接处理后的心肌干细胞(CPC(+RES))或CPC共培养时，在由多柔比星(终浓度10μg/mL、30μg/mL、50μg/mL)所致的细胞损伤下的细胞存活率。图5示出将心肌成肌细胞与导入了包封有白藜芦醇的线粒体靶向脂质体的心肌干细胞(CPC+RES-MITO-Porter)、用白藜芦醇直接处理后的心肌干细胞(CPC(+RES))或CPC共培养时，在由多柔比星(终浓度10μg/mL)所致的细胞损伤下经过48小时后的细胞存活率。图6是示出将心肌成肌细胞与MA-细胞共培养时，白藜芦醇的各用量下的、在由多柔比星(终浓度10μg/mL)所致的细胞损伤下的细胞存活率的图。图7是示出与移植了MA-细胞或CPC或者未处置的多柔比星心力衰竭模型小鼠和正常小鼠相关的Kaplan-Meier曲线的图。图8是示出移植了MA-细胞或CPC或者未处置的多柔比星心力衰竭模型小鼠和正常小鼠的平均体重的变化的图。图9是示出移植了MA-细胞或CPC或者未处置的多柔比星心力衰竭模型小鼠和正常小鼠的心脏组织中的二氢乙锭(DHE)阳性细胞率的图。图10是示出移植了MA本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于治疗和/或预防心力衰竭的心肌干细胞的制造方法，其包括将线粒体靶向载体与线粒体活化剂的复合物导入到心肌干细胞中的步骤。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.11.16 JP 2016-2230691.一种用于治疗和/或预防心力衰竭的心肌干细胞的制造方法，其包括将线粒体靶向载体与线粒体活化剂的复合物导入到心肌干细胞中的步骤。2.如权利要求1所述的制造方法，其中，所述复合物为包封有线粒体活化剂的线粒体靶向脂质体。3.如权利要求1或2所述的制造方法，其中，所述复合物为包封有线粒体活化剂、含有二油酰磷脂酰乙醇胺以及磷脂酸和/或鞘磷脂作为脂质膜的构成脂质、并且在脂质膜表面具有线粒体靶向分子的线粒体靶向脂质体。4.如权利要求3所述的制造方法，其中，线粒体靶向分子为由序列号1中记载的氨基酸序列构成的肽。5.如权利要求1～4中任一项所述的制造方法，其中，线粒体活化剂为白藜芦醇。6.一种心肌干细胞，其通过将线粒体靶向载体与线粒体活化剂的复合物导入到心肌干细胞中而制造。7.如权利要求6所述的心肌干细胞，其中，所述复合物为包封有线粒体活化剂的线粒体靶向脂质体。8....

【专利技术属性】
技术研发人员：原岛秀吉，山田勇磨，阿部二郎，武田充人，
申请(专利权)人：卢卡科学株式会社，
类型：发明
国别省市：日本,JP