抗梅毒螺旋体膜蛋白Tp47的单克隆抗体ZJTP47-1B3及其应用制造技术

本发明专利技术属于生物技术领域，涉及抗梅毒螺旋体膜蛋白Tp47的单克隆抗体的制备及应用，是利用细胞工程、抗体工程技术，获得分泌抗梅毒螺旋体膜蛋白Tp47的单克隆抗体的杂交瘤细胞系，抗体的重链氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，轻链氨基酸序列如SEQ ID No.4所示，鉴定为IgG1、κ型，再通过亲和纯化、电泳、免疫等技术实现对该抗体的应用。本发明专利技术的优点在于提供了一种抗梅毒螺旋体膜蛋白Tp47的单克隆抗体。制备方法简单易行，更为重要的是该方法制备的单克隆抗体可以有多种用途，如对临床和实验室的梅毒抗原诊断奠定了物质基础。

Monoclonal antibody ZJTP47-1B3 against Treponema pallidum membrane protein Tp47 and its application

【技术实现步骤摘要】
抗梅毒螺旋体膜蛋白Tp47的单克隆抗体ZJTP47-1B3及其应用
本专利技术属于生物
，涉及抗梅毒螺旋体膜蛋白Tp47的单克隆抗体的制备及应用，是利用细胞工程、抗体工程技术，获得分泌抗梅毒螺旋体膜蛋白Tp47的单克隆抗体的杂交瘤细胞系，通过同品系的小鼠诱导腹水，制备抗梅毒螺旋体膜蛋白Tp47的单克隆抗体ZJTP47-1B3，抗体的重链氨基酸序列如SEQIDNo.2所示，轻链氨基酸序列如SEQIDNo.4所示，鉴定为IgG1、κ型，再通过亲和纯化、电泳、免疫等技术实现对该抗体的应用。
技术介绍
梅毒是由苍白密螺旋体引起的一种常见的性传播疾病，可以侵犯全身皮肤、黏膜和多种器官。梅毒患者可以出现一期梅毒、二期梅毒的典型临床表现，亦可以表现为潜伏梅毒，少数患者还可以出现三期梅毒。近年来，梅毒发病率有上升趋势，据我国疾控中心统计，2017年梅毒的发病率为34.48/10万，这可能与男性性行为者“爆发”相关，导致这类特殊群体梅毒高发病率与不安全性行为相关，亦可能与HIV感染相关。梅毒与HIV感染的密切关系，使得这一公共卫生问题再次引起了大家的广泛关注。虽然I期梅毒硬下疳、II期扁平湿疣的皮疹形态极具诊断价值，但作为一个臭名昭著的“模仿者”，梅毒的临床表现往往错综复杂，另人琢磨不透。因此，实验室检测对于梅毒的诊断非常重要。一直以来，梅毒螺旋体暗视野检查是其诊断的金标准，但是此法对检验人员要求高，在大部分医院未能开展。其他的实验室检测包括：梅毒螺旋体特异性抗体及非特异性抗体的血清学检查，荧光定量聚合酶链反应法检测梅毒螺旋体DNA。目前血清学检测仍是梅毒诊断的最重要的方法，然而，梅毒血清学检测存在前带反应，血清固定，在感染初期尚未出现抗体导致未能及时诊断及特殊人群可能出现假阳性等问题。发展一种快速、灵敏的梅毒诊断抗体非常有必要。基于以上背景，本项目选定目前公认的梅毒螺旋体膜蛋白Tp47为靶抗原，利用分子生物学技术，成功表达、纯化了梅毒螺旋体膜蛋白Tp47，采用融合杂交瘤技术建立稳定分泌抗Tp47蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞系，并大量制备、纯化和鉴定这些单克隆抗体。该单克隆抗体的成功获得，为建立新梅毒诊断方法——基于免疫学技术的诊断奠定物质基础。本专利技术用到杂交瘤细胞技术。该技术将免疫小鼠的B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，以建立分泌均质抗体的杂交瘤细胞系，也称为单克隆抗体技术。该技术涉及到动物免疫、细胞培养、细胞融合、细胞克隆培养和免疫测定等一系列方法。
技术实现思路
为了解决以上问题，本专利技术提供了一种快速、灵敏的梅毒诊断抗体。本专利技术的目的是提供一种抗梅毒螺旋体膜蛋白Tp47的单克隆抗体，抗体的重链氨基酸序列如SEQIDNo.2所示(重链DNA序列如SEQIDNo.1)，轻链氨基酸序列如SEQIDNo.4所示(轻链DNA序列如SEQIDNo.3)；该单克隆抗体亚型为IgG1、κ型，命名为ZJTP47-1B3，能特异性识别梅毒螺旋体膜蛋白Tp47。抗体的重链序列SEQIDNo.1Heavychain:DNAsequence(408bp)Leadersequence-FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4ATGGGATGGAGCTCTATCATCCTCTTCTTGGTAGCAACAGCCTCAGGTGTCCACTCCCAGGTCCAACTACAGCAACCTGGGTCTGAGTTGGTGAGGCCTGGAGCTTCAGTGAAGCTGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACATTCGCCAGCTACTGGATGCACTGGGTGAAACAGAGGCCTGGACAAGGCCTTGAGTGGATTGGAAATATTTATCCTGGTAGTGGTCGTACTAACTACGATGAGAAGTTCAAGAGCAAGGCCACACTGACTGTAGACACATCCTCCAACACACCCTACATACAACTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCGGTCTATTACTGTGCAAGAGGTAACTTATATTCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCASEQIDNo.2Heavychain:Aminoacidssequence(136aa)Leadersequence-FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4MGWSSIILFLVATASGVHSQVQLQQPGSELVRPGASVKLSCKASGYTFASYWMHWVKQRPGQGLEWIGNIYPGSGRTNYDEKFKSKATLTVDTSSNTPYIQLSSLTSEDSAVYYCARGNLYSMDYWGQGTSVTVSS抗体的轻链序列SEQIDNo.3Lightchain:DNAsequence(393bp)Leadersequence-FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4ATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTGCTGCTGCTCTGGGTTCCAGGTTCCACTGGTGACATTGTGCTGACACAGTCTCCTGCTTCCTTAGCTGTATCTCTGGGGCAGAGGGCCACCGTCTCATGCAGGGCCAGCCAAAGTGTCAATACATCTAGCTATAGTTATTTGCACTGGTACCAACAGAAACCAGGACAGCCACCCAAACTCCTCATCAAATATGCATCCAACCTAGAATCTGGGGTCTCTGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACCCTCAACATCCATCCTGTGGAGGAGGAGGATAGTGCAACATATTACTGTCAGCACACTTGGGAGATTCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAASEQIDNo.4Lightchain:Aminoacidssequence(131aa)Leadersequence-FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4METDTLLLWVLLLWVPGSTGDIVLTQSPASLAVSLGQRATVSCRASQSVNTSSYSYLHWYQQKPGQPPKLLIKYASNLESGVSARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDSATYYCQHTWEIPYTFGGGTKLEIK所述抗体由杂交瘤细胞产生。所述杂交瘤细胞是由免疫的BALB/C小鼠脾淋巴细胞和小鼠骨髓瘤细胞SP2/0经融合、筛选、克隆、传代和反复冻存、复苏后获得的杂交瘤细胞系ZJTP47-1B3，能稳定分泌抗梅毒螺旋体膜蛋白Tp47的单克隆抗体ZJTP47-1B3。本专利技术的第二个目的是提供抗梅毒螺旋体膜蛋白Tp47的单克隆抗体的制备方法，通过以下步骤和技术方案实现：(1)动物的免疫：选择8周龄的BALB/C小鼠，以纯化的梅毒螺旋体膜蛋白Tp47进行免疫。梅毒螺旋体膜蛋白Tp47是由将梅毒螺旋体膜蛋白Tp47的基因序列克隆至pET-23a(+)载体，经异丙基硫代半乳糖苷诱导在BL21(DE3)中表达、纯化获得，经WesternBlot鉴定与目的蛋白符合。(2)小鼠骨髓瘤细胞的培养：培养小本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种抗梅毒螺旋体膜蛋白Tp47的单克隆抗体ZJTP47‑1B3，抗体的重链氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，轻链氨基酸序列如SEQ ID No.4所示；该单克隆抗体亚型为IgG1、κ型，能与梅毒螺旋体膜蛋白Tp47特异结合。

【技术特征摘要】
1.一种抗梅毒螺旋体膜蛋白Tp47的单克隆抗体ZJTP47-1B3，抗体的重链氨基酸序列如SEQIDNo.2所示，轻链氨基酸序列如SEQIDNo.4所示；该单克隆抗体亚型为IgG1、κ型，能与梅毒螺旋体膜蛋白Tp47特异结合。2.根据权利要求1所述的单克隆抗体ZJTP47-1B3，其特征在于：所述抗体由杂交瘤细胞产生。3.根据权利要求2所述的单克隆抗体ZJTP47-1B3，其特征在于：杂交瘤细胞是由免疫的BALB/C小鼠脾淋巴细胞和小鼠骨髓瘤细胞SP2/0经融合、筛选、克隆、传代和反复冻存、复苏后获得的杂交瘤细胞系ZJTP47-1B3，能稳定分泌抗梅毒螺旋体膜蛋白Tp47的单克隆抗体ZJTP47-1B3。4.一种杂交瘤细胞，其特征在于：能稳定分泌抗梅毒螺旋体膜蛋白Tp47的单克隆抗体ZJTP47-1B3。5.根据权利要求1所述的抗梅毒螺旋体膜蛋白Tp47的单克隆抗体ZJTP47-1B3的制备方法，其特征在于：该单克隆抗体通过以下步骤获得：(1)小鼠免疫：选择8周龄的BALB/C小鼠，以重组表达的梅毒螺旋体膜蛋白Tp47对小鼠进行免疫；每只小鼠以200ug的抗原蛋白混合佐剂后大腿内侧肌肉注射免疫，第21天后再免疫一次，共2次；第3次加强免疫3天后用于融合；(2)小鼠骨髓瘤细胞的培养：培养小鼠骨髓瘤细胞SP2/0并使其保持良好的生长状态用于杂交瘤细胞融合；(3)细胞融合：采用聚乙二醇细胞融合法；以BALB/C小鼠腹腔巨噬细胞作为饲养细胞，在融合前一天，接种BALB/C小鼠腹腔巨噬细胞于96孔培养板，含20％FBS的HAT培养基培养一天，将步骤(1)中备好的小...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴南屏，陈彬，姚航平，吴海波，
申请(专利权)人：浙江大学医学院附属第一医院，
类型：发明
国别省市：浙江,33