siRNA-生物钙化重组去铁蛋白纳米粒及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种siRNA‑生物钙化重组去铁蛋白纳米粒及其制备方法，所述siRNA‑生物钙化重组去铁蛋白纳米粒包括重组去铁蛋白外壳，在重组去铁蛋白外壳内包载有siRNA和磷酸钙组成的内核。以重组去铁蛋白和磷酸钙作为复合载体，所制得的纳米粒尺寸均一，分散性好，具有主动靶向性，能保护siRNA避免酶降解，同时具有溶酶体逃逸的能力及优异的生物相容性。

【技术实现步骤摘要】
siRNA-生物钙化重组去铁蛋白纳米粒及其制备方法
本专利技术属于生物医药
，具体涉及一种用于递送siRNA的生物钙化重组去铁蛋白纳米粒及其制备方法。
技术介绍
RNA干扰(RNAinterference，RNAi)是通过沉默特定的基因表达来治疗某些因基因异常所致的疾病。siRNA(SmallinterferingRNA)是RNAi过程中的中间产物，其能够特异性的结合RNA诱导沉默复合物(RNA-inducedsilencingcomplex，RISC)，在与RISC结合的siRNA单链的引导下，选择性降解与之互补的mRNA，从而选择性的下调引起疾病的基因，发挥RNAi的作用。siRNA对靶基因具有较高的特异性，可显著降低传统药物治疗引起的非特异性的毒副作用，因此在治疗人类疾病特别是恶性肿瘤方面具有很大的前景。siRNA分子本身具有较大的分子量(～13KDa)并带有较强的负电荷，使siRNA很难穿透细胞膜，同时siRNA在生理条件下易被酶所降解，因此游离siRNA很难进入作用部位发挥基因沉默的作用。所以构建适宜的siRNA递送系统使siRNA到达胞浆发挥作用是RNAi发挥疗效的必要条件。目前用于siRNA递送的载体主要有病毒载体和非病毒载体。病毒载体是强有力的基因转染工具，但因其具有免疫原性和致癌性等不安全因素，限制了其在临床上的应用。用于siRNA递送的非病毒载体主要有脂质体、脂质复合物、阳离子聚合物、无机载体等。因为无机载体具有较高的转染效率，因此其被广泛应用于siRNA的递送。磷酸钙(CaP)属于无机非病毒载体，其是人体的组成部分，以其作为siRNA的递送载体，具有高转染效率、高生物相容性和良好的生物降解性等巨大优势。siRNA的核酸骨架可与钙离子形成复合物，因此可以保护siRNA免受血清核酸酶的降解，增强siRNA在生理条件下的稳定性。此外，CaP可以在酸性条件下溶解，如溶酶体环境下，从而产生质子化海绵作用使溶酶体破裂，从而将siRNA递送至作用部位发挥作用。然而，CaP载体存在以下几个关键缺点：在溶液中晶体的生长快速且不可控、制备低重现性、稳定性差且缺乏组织特异性。目前，研究热点在于使用脂质体或者其他高分子材料对磷酸钙进行包裹，从而控制其粒径大小。黄佳琳等[Huang,J.L.etal.Lipoprotein-biomimeticnanostructureenablesefficienttargetingdeliveryofsiRNAtoRas-activatedglioblastomacellsviamacropinocytosis.NatureCommunications8,15144(2017).]采用重组高密度脂蛋白纳米载体进一步包裹siRNA的磷酸钙核心，利用酸敏感的磷酸钙核心可在溶酶体中溶解并释放siRNA，产生的钙离子和磷酸根离子增加溶酶体的渗透压引起溶酶体肿胀破裂，从而将siRNA释放至胞质中发挥作用。但是，这些载体具有制备工艺复杂、使用有机溶剂、生物相容性差、需进行配体修饰等缺点。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有磷酸钙作为siRNA递送载体存在的在溶液中晶体生长快速且不可控、制备低重现性、稳定性差、缺乏组织特异性的缺点，提供一种新的siRNA载体系统，以重组去铁蛋白和磷酸钙作为复合载体，所制得的纳米粒尺寸均一，分散性好，具有主动靶向性，能保护siRNA避免酶降解，同时具有溶酶体逃逸的能力及优异的生物相容性。为了实现上述专利技术目的，本专利技术采用的技术方案如下：一种siRNA-生物钙化重组去铁蛋白纳米粒，包括重组去铁蛋白外壳，在重组去铁蛋白外壳内包载有siRNA和磷酸钙组成的内核。进一步地，所述纳米粒的粒径为10-50nm。上述siRNA-生物钙化重组去铁蛋白纳米粒的制备方法，包括以下步骤：步骤1，利用基因工程重组表达技术制备重组去铁蛋白；步骤2，将步骤1得到的重组去铁蛋白制成溶液，调节pH至1.0-2.0，使重组去铁蛋白解聚成亚基单元；步骤3，向步骤2得到的溶液中加入氯化钙溶液和siRNA溶液，混合均匀；步骤4，调节步骤3混合溶液的pH至8.0-11.0，使重组去铁蛋白复聚成笼状结构，在空笼中包载siRNA分子；步骤5，向步骤4的溶液中加入磷酸氢二钠溶液，在4-37℃条件下振摇，使重组去铁蛋白空腔中生成磷酸钙，制得siRNA-生物钙化重组去铁蛋白纳米粒。进一步地，步骤1中利用基因工程重组表达技术制备重组去铁蛋白的具体过程为：先将FTH基因亚克隆至质粒载体pET-30a(+)中，再将其转化至E.coilArcticExpressTM的感受态细胞中，通过卡那霉素的抗性筛选阳性单克隆转化子，获得目的重组去铁蛋白表达工程菌，然后将工程菌接种于LB-Kan+培养基中，加入IPTG诱导蛋白表达得到菌体，采用超声波破碎得到的菌体，离心收集上清液，将上清液置于40-80℃条件下水浴加热，再次离心获得含有目的蛋白的上清液，采用镍柱亲和层析法对上清液的杂蛋白及目的蛋白进行分离纯化，得到重组去铁蛋白。进一步地，步骤2中重组去铁蛋白与siRNA的摩尔比为40:1-1:1。进一步地，所述氯化钙溶液的浓度为5-200mmol/L。进一步地，所述磷酸氢二钠溶液的浓度为1-500mmol/L。进一步地，步骤5中的振摇条件为4-25℃、2-48h。本专利技术的生物钙化重组去铁蛋白递送系统不仅具有优异的生物相容性和稳定性，还可实现肿瘤部位的主动靶向，降低毒副作用，且以其为矿化反应容器进行磷酸钙载体的制备方法简单易行，为基因药物有效的靶向递送提供了一种理想的多功能纳米载体，具有较好的应用前景。附图说明图1为本专利技术中siRNA-生物钙化重组去铁蛋白纳米粒的制备流程图。图2为施例1中重组去铁蛋白(HFn)在镍柱亲和层析法纯化过程中各流出液的SDS-PAGE图。图3为实施例1中所制备的HFn@CaP/siRNA纳米粒粒径分布图。图4为实施例1中重组去铁蛋白透射电镜负染(A)和不负染(B)图，以及HFn@CaP/siRNA纳米粒透射电镜负染(C)和不负染(D)图。图5为实施例1中HFn@CaP/siRNA纳米粒酶解稳定性实验(A)和血清稳定性实验(B)。图6为HFn@CaP纳米粒溶酶体逃逸能力考察图。具体实施方式重组去铁蛋白是一种天然的蛋白质，其具有良好的生物相容性、生物降解性及稳定性，同时其还能与肿瘤细胞表面高表达的转铁蛋白受体1(TfR1)发生特异性结合，实现有效入胞，从而达到主动靶向的效果。重组去铁蛋白还可作为矿化支架，以笼状的中空空腔作为化学反应容器进行无机纳米粒的合成。LeLi等[Li,L.etal.Ferritin-mediatedsiRNAdeliveryandgenesilencinginhumantumorandprimarycells.Biomaterials98,143-151(2016).]采用重组去铁蛋白包载siRNA从而实现siRNA在肿瘤细胞和原代细胞中的体外基因沉默。但是其溶酶体逃逸的理论仅仅为一种假设，建立在重组去铁蛋白核靶向的理论基础上，因此需要更明确的方式保证siRNA能成功到达胞浆，发挥基因沉默的作用。本专利技术为了克服现有磷酸钙载体的缺点，选用重组去铁蛋白作为siRNA载体本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.siRNA‑生物钙化重组去铁蛋白纳米粒，其特征在于：包括重组去铁蛋白外壳，在重组去铁蛋白外壳内包载有siRNA和磷酸钙组成的内核。

【技术特征摘要】
1.siRNA-生物钙化重组去铁蛋白纳米粒，其特征在于：包括重组去铁蛋白外壳，在重组去铁蛋白外壳内包载有siRNA和磷酸钙组成的内核。2.根据权利要求1所述的siRNA-生物钙化重组去铁蛋白纳米粒，其特征在于：所述纳米粒的粒径为10-50nm。3.权利要求1所述的siRNA-生物钙化重组去铁蛋白纳米粒的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：步骤1，利用基因工程重组表达技术制备重组去铁蛋白；步骤2，将步骤1得到的重组去铁蛋白制成溶液，调节pH至1.0-2.0，使重组去铁蛋白解聚成亚基单元；步骤3，向步骤2得到的溶液中加入氯化钙溶液和siRNA溶液，混合均匀；步骤4，调节步骤3混合溶液的pH至8.0-11.0，使重组去铁蛋白复聚成笼状结构，在空笼中包载siRNA分子；步骤5，向步骤4的溶液中加入磷酸氢二钠溶液，在4-37℃条件下振摇，使重组去铁蛋白空腔中生成磷酸钙，制得siRNA-生物钙化重组去铁蛋白纳米粒。4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：步骤1中利用基因工程重组...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴正红，黄海琴，祁小乐，
申请(专利权)人：中国药科大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32