【技术实现步骤摘要】
用于高表达外源蛋白的大肠杆菌及其构建方法与应用
本专利技术属于遗传工程领域，特别涉及一种用于高表达外源蛋白的大肠杆菌的构建方法及其应用。
技术介绍
大肠杆菌(E.coli)因其自身的优势可作为外源蛋白的独特系统，如成本低、产量高、生长速度快、转化效率高、可在短时间内获得目的蛋白并对其进行纯化和分析，且最终蛋白产量较高。相比之下，用于获得完整抗体分子的哺乳动物细胞系统的缺点是生产成本高、表达周期长。所以大肠杆菌是大多数科学研究及应用中实现蛋白表达的首选宿主。但大肠杆菌在表达一些含有复杂二硫键结构的或者需要转译后修饰的蛋白方面还存在一些问题。由于大肠杆菌周质空间具有独特优势，多数重组蛋白选择在大肠杆菌周质空间表达。大肠杆菌有内膜和外膜组成的双层膜结构，在内膜和外膜之间的区域即所谓的周质(periplasmicspace)。利用大肠杆菌系统,在外源基因的N端融合一段细菌蛋白的疏水信号肽,可将目的蛋白运送到周质空间，经信号肽酶将信号肽切除后，即可获得与天然蛋白一致的构象(不含N端多余的甲硫氨酸)。E.coli的细胞周质中含有一系列的酶，并提供了一个氧化的环境，这些都有利于...
【技术保护点】
1.一种用于高表达外源蛋白的大肠杆菌，其特征在于，所述大肠杆菌的基因型缺失prc基因，并携带突变的spr基因和突变的ilvG基因；所述突变的spr基因为：spr基因编码的174位由色氨酸突变为精氨酸或赖氨酸；所述突变的ilvG基因为：ilvG基因的981bp位置处插入“TA”两个碱基。
【技术特征摘要】
1.一种用于高表达外源蛋白的大肠杆菌，其特征在于，所述大肠杆菌的基因型缺失prc基因，并携带突变的spr基因和突变的ilvG基因；所述突变的spr基因为：spr基因编码的174位由色氨酸突变为精氨酸或赖氨酸；所述突变的ilvG基因为：ilvG基因的981bp位置处插入“TA”两个碱基。2.根据权利要求1所述的用于高表达外源蛋白的大肠杆菌，其特征在于，所述突变的spr基因序列如SEQIDNO.6所示；和/或所述突变的ilvG基因序列如SEQIDNO.17所示。3.根据权利要求1或2所述的用于高表达外源蛋白的大肠杆菌，其特征在于，所述用于高表达外源蛋白的大肠杆菌在E.colistrainW3110的基础上改造得到。4.根据权利要求3所述的用于高表达外源蛋白的大肠杆菌，其特征在于，所述大肠杆菌的基因型为tonAptr3△phoA△E15△(argF-lac)169degP41△ompTkanRsprW174RilvG+2096。5.一种用于高表达外源蛋白的大肠杆菌的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将大肠杆菌的spr基因的编码174位色氨酸的序列突变为编码精氨酸或赖氨酸的序列，即得携带突变的spr基因的大肠杆菌BAT47/sprW174R；(2)在ilvG基因的981bp位置插入“TA”两个碱基，即得即得携带突变的ilvG基因的大肠杆菌BAT47/sprW174R/ilvGta；(3)敲除prc基因。6.根据权利要求5所述的用于高表达外源蛋白的大肠杆菌的构建方法，其特征在于，步骤(1)所述的将大肠杆菌的spr基因的编码174位色氨酸的序列突变为编码精氨酸的序列的方法为：通过基因打靶技术，将突变的spr基因整合到所述大肠杆菌的基因组中；和/或步骤(2)所述的在ilvG基因的981bp位置插入“TA”两个碱基的方法为：通过基因打靶技术，将突变的ilvG基因整合到所述大肠杆菌的基因组中。7.根据权利要求6所述的用于高表达外源蛋白的大肠杆菌的构建方法，其特征在于，所述将突变的spr基因整合到所述大肠杆菌的基因组中，步骤包括：构建打靶载体：将含有突变的spr基因的打靶序列与pCVD442质粒通过XbaI酶切位点连接，得打靶载体pCVD442-spr；制备供体菌株：将所述打靶载体pCVD442-spr转化入大肠杆菌β2155菌株，得供体菌株β2155/pCVD442-spr；将所述供体菌株β2155/pCVD442-spr与受体菌株大肠杆菌E.colistrainW3110...
【专利技术属性】
技术研发人员：吴晓云，黄俊杰，李胜峰，俞金泉，
申请(专利权)人：百奥泰生物制药股份有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44
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