一种靶向BCMA的嵌合抗原受体及其应用制造技术

本发明专利技术涉及一种靶向BCMA的嵌合抗原受体，包括胞外识别区、铰链区、跨膜区和胞内信号区，所述胞外识别区为抗‑BCMA纳米抗体序列，所述抗‑BCMA纳米抗体序列为结合BCMA的来源于羊驼的重链可变区序列。更具体地，所述抗‑BCMA纳米抗体序列为BCMA单克隆抗体B1或B65，所述B1的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述B65的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明专利技术采用羊驼来源的纳米抗体，相比传统的鼠源或人源化的SCFV具有较小分子量及免疫原性，以此为基础制备的CAR‑T细胞在体内产生HAMA效应的可能性更小，其在体内存留时间可能更长，其通过靶向肿瘤细胞表面的BCMA蛋白并激活T细胞下游的信号通路，赋予T细胞杀伤带有BCMA靶点肿瘤细胞的能力，可高效特异的治疗BCMA阳性血液肿瘤。

A chimeric antigen receptor targeting BCMA and its application

【技术实现步骤摘要】
一种靶向BCMA的嵌合抗原受体及其应用
本专利技术涉及细胞免疫治疗
，尤其涉及一种靶向BCMA的嵌合抗原受体及其应用。
技术介绍
B细胞成熟抗原(Bcellmaturationantigen，BCMA)是一种表达在浆细胞，浆母细胞和骨髓浆细胞的抗原，其不在B细胞或者造血干细胞上表达。BCMA的表达与许多癌症，自身免疫性疾病和感染性疾病相关。具有增加的BCMA表达的癌症包括一些血液癌症，例如多发性骨髓瘤，霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤，各种白血病和胶质母细胞瘤等。这种有限的表达细胞类型，使得BCMA可能作为治疗血液瘤的靶点，以开发单抗、抗体偶联药物、双特异性抗体、CAR-T等疗法。当前还没有靶向BCMA的药物上市，但是有少数通过抗体偶联药物，CAR-T疗法等来通过靶向BCMA以治疗多发性骨髓瘤的疗法在进行临床试验，CAR-T技术在多发性骨髓瘤领域的应用取得了一定的效果，欧美临床试验的数据表明，现有的BCMAchimericantigenreceptorT(carT)技术，治疗多发性骨髓瘤客观治愈率(objectiveresponse，OBB)达50％左右，但还存在的临床不足如下：治疗有效率低于典型的CD19carT70-90％完全治愈率，有效率有待提高。纳米抗体是目前已知的可结合目标抗原的最小单位，分子量只有15KD，是传统抗体的十分之一；临床上应用较多的鼠源抗体，免疫原性更强，更可能产生HAMA效应，即人抗鼠抗体效应，这种效应会导致鼠源性单抗对人体具有异种蛋白的免疫原性，在人体内半衰期较短，多次使用可引起人抗鼠抗体(HAMA)的产生，从而使其应用受到限制。存在于骆驼或者羊驼等动物体内的重链抗结构简单，仅包含重链可变区，不包含轻链。进一步的，其重链可变区被称为单域抗体或者是纳米抗体。相较于普通的抗体结构，单域抗体具有分子小，结构更简单，稳定性高，易表达等特点。并且其与人源抗体VH3的序列高度同源，其同源性远超过鼠源单克隆抗体。基于以上优点，近年来对骆驼或者羊驼来源的纳米抗体的研究以及在疾病诊断和治疗中的应用越来越广泛。因此，开发一种含有靶向BCMA的单域抗体的嵌合抗原受体对高效特异的治疗BCMA阳性血液肿瘤具有十分重要的意义。
技术实现思路
基于现有技术中存在的缺陷，本专利技术提供一种BCMA特异性嵌合抗原受体(CAR)，这种CAR分子含有的单链抗体序列仅含有重链可变区，其减小靶向BCMA抗原的CAR分子中SCFV序列的免疫原性，延长CAR-T细胞在体内的存活时间，本专利技术还验证其在血液瘤治疗中的潜在应用。为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：本专利技术的第一个目的是提供一种靶向B细胞成熟抗原(BCMA)的嵌合抗原受体，包括胞外识别区、铰链区、跨膜区和胞内信号区，所述胞外识别区为抗-BCMA纳米抗体序列，所述抗-BCMA纳米抗体序列为结合BCMA的来源于羊驼的重链可变区(scFv)序列。为了进一步优化上述嵌合抗原受体，本专利技术所采取的技术措施还包括：进一步地，所述抗-BCMA纳米抗体序列为BCMA单克隆抗体B1或B65，所述B1的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示，所述B65的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。进一步地，所述铰链区为CD8hinge区域。更进一步地，所述CD8hinge区域的氨基酸序列如SEQIDNO.3所示进一步地，所述跨膜区选自CD8跨膜区、CD28跨膜区、ICOS跨膜区中的任一个。更进一步地，所述CD8跨膜区的氨基酸序列如SEQIDNO.4所示，所述CD28跨膜区的氨基酸序列如SEQIDNO.5所示，所述ICOS跨膜区的氨基酸序列如SEQIDNO.6所示。进一步地，所述胞内信号区包含CD28、4-1BB、ICOS、CD3ζ中的至少一个。更进一步地，所述CD28的氨基酸序列如SEQIDNO.7所示，所述4-1BB的氨基酸序列如SEQIDNO.8所示，所述ICOS的氨基酸序列如SEQIDNO.9所示，所述CD3ζ的氨基酸序列如SEQIDNO.10所示。进一步地，基于以上BCMA特异性CAR分子的结构，所述BCMA嵌合抗原受体为B1-BBZ，其胞外识别区为B1，铰链区为CD8hinge区域，跨膜区为CD8，胞内信号区为4-1BB-CD3ζ。更进一步地，所述B1-BBZ的氨基酸序列如SEQIDNO.11所示。进一步地，所述BCMA嵌合抗原受体为B65-BBZ，其胞外识别区为B65，铰链区为CD8hinge区域，跨膜区为CD8，胞内信号区为4-1BB-CD3ζ。更进一步地，所述B65-BBZ的氨基酸序列如SEQIDNO.12所示。可以理解的是，也可根据本领域适用的其他结构来组成BCMA嵌合抗原受体。进一步地，在不同的CAR分子中，其跨膜区可相同，也可不同；其胞内信号区可相同，也可不同。本专利技术的第二个目的是提供一种编码任一上述的BCMA特异性嵌合抗原受体的核酸。进一步地，所述核酸包括SEQIDNO.13～SEQIDNO.14所示的核苷酸序列中的至少一个。更具体地，SEQIDNO.13所示序列的核酸编码所述B1-BBZ，SEQIDNO.14所示序列的核酸编码所述B65-BBZ。上述CAR分子的氨基酸序列及其编码核酸序列如下表所示：本专利技术的第三个目的是提供一种含有上述核酸的重组表达载体。进一步地，所述重组表达载体包括慢病毒、逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒或质粒等；更进一步地，原始重组表达载体为慢病毒。在一具体实施方式中，所使用的载体为慢病毒载体。CAR慢病毒载体质粒在辅助包装质粒pSPAX2和VSV-G包膜质粒pMD2.G存在的情况下，共转染HEK293T细胞，即可包装为带有CAR分子的慢病毒。本专利技术的第四个目的是提供一种含有上述重组表达载体的宿主细胞。进一步地，所述宿主细胞为T细胞或含有T细胞的细胞群本专利技术的第五个目的是提供一种上述宿主细胞的构建方法，其包括重组表达载体的构建步骤、重组表达载体的包装步骤以及将重组表达载体转导至宿主细胞的步骤。本专利技术的第六个目的是提供上述BCMA特异性嵌合抗原受体，上述核酸，上述重组表达载体以及上述宿主细胞在制备哺乳动物血液瘤治疗药物中的应用。进一步地，哺乳动物血液瘤主要包括各类白血病、多发性骨髓瘤以及恶性淋巴瘤等。进一步地，所述应用为一种BCMA特异性的CAR-T细胞，其通过慢病毒介导的转导使得T细胞带有BCMA特异性CAR，从而赋予了T细胞识别BCMA分子的能力，并靶向BCMA阳性的哺乳动物多发性骨髓瘤。在一个具体实施方式中，将BCMACAR-T细胞与表达BCMA的肿瘤细胞系U266及人工构建的表达BCMA的肿瘤细胞系A549-BCMA共孵育，结果显示BCMACAR-T细胞能够在靶细胞的刺激下大量的产生IFN-γ及IL2；但是却不能在与BCMA阴性的细胞系A549共孵育时产生IFN-γ及IL2；同时T细胞不能够在BCMA阳性细胞刺激下产生IFN-γ及IL2。该实施例说明了BCMACAR-T细胞的良好的特异性靶向性，能够在BCMA刺激下将T细胞杀伤功能激活，且B1-BBZ及B65-BBZ体外杀伤BCMA阳性肿瘤细胞的活性优于11D5-3-28Z(B1-BBZ、B65-BBZ、11D5-3-28Z的结构如图1所示)。在另一个具体实施方式中，证明了在一定的效靶比(本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种靶向BCMA的嵌合抗原受体，包括包括胞外识别区、铰链区、跨膜区和胞内信号区，其特征在于，所述胞外识别区为抗‑BCMA纳米抗体序列，所述抗‑BCMA纳米抗体序列为结合BCMA的来源于羊驼的重链可变区序列。

【技术特征摘要】
1.一种靶向BCMA的嵌合抗原受体，包括包括胞外识别区、铰链区、跨膜区和胞内信号区，其特征在于，所述胞外识别区为抗-BCMA纳米抗体序列，所述抗-BCMA纳米抗体序列为结合BCMA的来源于羊驼的重链可变区序列。2.根据权利要求1所述的一种靶向BCMA的嵌合抗原受体，其特征在于，所述抗-BCMA纳米抗体序列为BCMA单克隆抗体B1或B65，所述B1的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示，所述B65的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。3.根据权利要求1所述的一种靶向BCMA的嵌合抗原受体，其特征在于，所述铰链区为CD8hinge区域，其氨基酸序列如SEQIDNO.3所示。4.根据权利要求1所述的一种靶向BCMA的嵌合抗原受体，其特征在于，所述所述跨膜区选自CD8跨膜区、CD28跨膜区、ICOS跨膜区中的任一个。5.根据权利要求4所述的一种靶向BCMA的嵌合抗原受体，其特征在于，所述CD8跨膜区的氨基酸序列如SEQIDNO.4所示，所述CD28跨膜区的氨基酸序列如SEQIDNO.5所示，所述ICOS跨膜区的氨基酸序列如SEQIDNO.6所示。6.根据权利要求1所述的一种靶向BCMA的嵌合抗原受体，其特征在于，所述胞内信号区包含CD28、4-1BB、ICOS、CD3ζ中的至少一个。7.根据权利要求6所述的一种靶向BCMA的嵌合抗原受体，其特征在于，所述CD28的氨基酸序列如SEQIDNO.7所示，所述4-1BB的氨基酸序列如SEQIDNO.8所示，所述ICOS的氨基酸序列如SEQ...

【专利技术属性】
技术研发人员：郝瑞栋，李彦涛，刘根桃，张大挺，易桥勇，红丽，吴国祥，
申请(专利权)人：上海科棋药业科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31