一种具有延缓细胞衰老作用的支架材料及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种具有延缓细胞衰老作用的支架材料及其应用，所述支架材料为接枝有白藜芦醇的聚乳酸‑己内酯支架材料。本发明专利技术提供的支架材料经表征和细胞培养研究，表明修饰后的支架材料不仅由于增加了亲水基团，克服了支架本体疏水、孔隙过小而不利于细胞生长的缺陷，并且该材料能显著延缓细胞衰老。该材料修饰方法简单易行，效果显著，用于养肝种子细胞，具有延缓细胞衰老，提高种子细胞活力的功效，为肝组织工程制备奠定良好基础。为解决肝脏组织工程研究中的细胞寿命问题提供新方法。

【技术实现步骤摘要】
一种具有延缓细胞衰老作用的支架材料及其应用
本专利技术涉及组织工程
，更具体地，涉及一种具有延缓细胞衰老作用的支架材料及其应用。
技术介绍
我国是肝脏疾病高发地区，各种肝脏疾病严重危害人体健康。肝移植是目前治疗急慢性肝功能衰竭以及其它严重肝病的主要途径。然而受到肝脏供体来源的限制，其临床应用面临极大困难。作为可持续性提供肝脏组织的理想途径，组织工程有望成为解决肝脏疾病临床困境的有效方案。肝组织工程学是将生物学和工程学的原理结合而产生的一门新兴学科，其核心就是建立细胞与生物材料的三维空间复合体，即具有生命力的活体组织，用以对病损组织进行形态、结构和功能的重建并达到永久性替代。在构建可移植肝脏的组织工程研究中，种子细胞在体外的培养过程中，由于长期培养、传代、营养及溶氧等因素影响，种植于支架材料上的种子细胞极易出现细胞老化而停止分泌基质，从而导致大面积出现细胞衰老、继而死亡的现象，大面积种子细胞死亡导致钙化并阻碍构建的组织工程应用于活体。因而这是肝脏组织工程研究中亟待解决的关键问题。细胞衰老是细胞受到某些特定刺激以后而被激活的细胞应答程序。长期以来，人们致力于研究细胞衰老后的各种表型特征以及能够激活衰老程序的分子机制和信号通路。研究表明，端粒酶缩短，基因组损伤以及肿瘤抑制信号的激活等均可以诱导细胞衰老。细胞一旦发生衰老，细胞形态发生改变：细胞变得扁平，体积增大，并且伴随着溶酶体活性(SA-β-Gal)的升高。同时，细胞周期停滞在G0或G1期，细胞增殖能力减弱。诱导细胞衰老的主要信号通路包括Ras-p53通路、p16-Rb通路以及p53/p16非依赖性的信号通路，如SKP2-p27相关信号通路。细胞衰老在限制肿瘤发展及纤维化疾病治疗方面发挥重要作用，但在组织工程研究中却影响种子细胞活力和可移植组织工程材料的制备，成为体外肝组织工程体外制备的重要瓶颈。为解决组织工程中的细胞衰老问题，各种延缓细胞衰老、增强种子细胞活力的研究工作正陆续开展，主要包括：1)利用生长因子促进细胞增殖，延缓细胞衰老，如Haojie等在培养介质上覆盖沃顿胶用于延缓干细胞衰老，其中沃顿胶中含有丰富的生长因子；2)脱细胞支架的应用，脱细胞支架是经过脱细胞处理、保留完整血管网络结构的三维支架，该支架结构为细胞的贴附和增殖提供适宜微环境，具有促进细胞生长，延缓细胞衰老的效果；3)细胞外基质(extracellularmatrix，ECM)的应用，ECM是由细胞合成并分泌到胞外、分布在细胞表面或细胞之间的大分子所形成的网状结构，为细胞生长提供合适环境，促进细胞增殖和延缓细胞衰老。由此可见，目前的研究工作中延缓细胞衰老的效果主要通过细胞因子的促进细胞生长作用而实现，但在实际应用中受到成本昂贵，制作复杂等因素限制。白藜芦醇(Resveratrol,RSV)属于非黄酮类多酚化合物，是植物在逆境下产生的一种天然的植物抗毒素。因其具有预防心血管疾病，降低血脂，延缓衰老，抗癌等功效备受广泛关注。目前通过开发各种以提高白藜芦醇生物利用度的各种制剂，如脂质体、纳米颗粒及胶束等生物制剂。同时，白藜芦醇因其具有延缓衰老、促进成骨细胞分化而在骨组织工程中已有初步尝试，如在骨组织工程中开发胶原/白藜芦醇支架材料有利于骨组织再生，表明白藜芦醇可装载于支架材料上进行释放而调节细胞生长的功能。但是目前研究表明，对于内皮祖细胞，低浓度(<50μmol/L)的白藜芦醇才具有延缓细胞衰老之调节功能，而高浓度(>50μmol/L)的白藜芦醇则抑制细胞生长。同时，对于间充质干细胞，低浓度的白藜芦醇已被证实能够通过SIRT1途径有效延缓细胞衰老，其是衰老相关蛋白SIRT1的天然活化剂，在机体内可作用于SIRT1氨基端激活域，使该结构域中保守的谷氨酸到赖氨酸或丙氨酸序列改变，从而使非组氨酸蛋白如FOXO1/3、核转录因子(NF)-Kb等表达增加，同时p53、p21等衰老相关的蛋白表达下调。但是目前未有将其应用到肝组织工程研究中的报道，请不清楚其对于肝种子是否能还具有促进细胞生长并延缓细胞衰老的作用。天然材料或人工高分子聚合物能够为细胞提供基质环境，P(CL-DLLA)作为聚乳酸和聚己内酯的共混材料，具有良好的韧性和降解性能等，是肝组织工程合适的支架材料。而支架P(CL-DLLA)本体疏水性较强，孔隙过小而存在不利于细胞生长的缺陷。综上所述，目前缺乏一种合适的利用白藜芦醇并控制其释放的可降解支架，并能够延缓细胞衰老、成本低，方法简单、浓度可控，这是将其用于肝种子细胞的培养首要面临的解决问题。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了克服现有技术的不足，提供一种能够促进细胞生长并延缓肝种子细胞衰老的高分子聚合物支架材料及其应用。本专利技术的第一个目的是提供一种延缓细胞衰老的支架材料。本专利技术的第二个目的是提供一种延缓细胞衰老的支架材料的制备方法。本专利技术的第三个目的是提供所述的制备方法制备得到的支架材料。本专利技术的第四个目的是提供所述支架材料在肝组织工程和/或延缓细胞衰老中的应用。为了实现上述目的，本专利技术是通过以下技术方案予以实现的：如图1所示，本专利技术，二苯甲酮(BP)为引发剂，通过紫外光接枝法将丙烯酸(AA)修饰于聚乳酸-己内酯支架材料(P(CL-DLLA))上，具有-COOH基团的AA-P(CL-DLLA)，将RSV溶于1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)乙醇溶液，再通过酯化反应将具有延缓细胞衰老作用的白藜芦醇(RSV)接枝到AA-P(CL-DLLA)上形成RSV-AA-P(CL-DLLA)支架材料。将此三维支架材料用于肝种子细胞培养，结果显示该支架材料能够明显延缓肝种子细胞衰老。红外结构图谱显示RSV-AA-P(CL-DLLA支架材料存在苯环C＝C的伸缩振动峰；XPS结构显示RSV-AA-P(CL-DLLA)的C、O元素比例同P(CL-DLLA)及AA-P(CL-DLLA)比较存在明显差异，初步显示RSV已成功接枝于AA-P(CL-DLLA)上；扫描电镜显示RSV-AA-P(CL-DLLA)支架拥有复杂的表面/内部微环境，支架孔隙增大，解决了原材料P(CL-DLLA)本身疏水、孔隙过小等不利于细胞粘附生长的缺陷，可为细胞培养提供良好的基质环境。将大鼠肝星状细胞(HSC)接种于RSV-AA-P(CL-DLLA)支架材料上培养4天，对支架材料上释放的RSV含量进行HPLC分析，结果发现RSV-AA-P(CL-DLLA)能够缓慢释放RSV，其释放的RSV最高浓度约在6.0μmol/L左右；MTT结果显示三种材料上HSC细胞均能够正常生长增殖，但RSV-AA-P(CL-DLLA)上细胞的存活率最高；活性氧ROS分析显示生长在RSV-AA-P(CL-DLLA)支架材料的衰老细胞数量较少。综合结果显示RSV-AA-P(CL-DLLA)支架材料具有延缓肝种子细胞衰老的功能。因此本专利技术要求保护一种延缓细胞衰老的支架材料，所述支架材料为接枝有白藜芦醇的聚乳酸-己内酯支架材料。优选地，所述支架材料为白藜芦醇通过羰基接枝于聚乳酸-己内酯支架材料。同时，本专利技术还要求保护一种延缓细胞衰老的支架材料的制备方法，在聚乳酸-己内酯支架材料上接枝白藜芦醇。优选地，包括以下步骤：S1.聚乳酸-己内本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种延缓细胞衰老的支架材料，其特征在于，所述支架材料为接枝有白藜芦醇的聚乳酸‑己内酯支架材料。

【技术特征摘要】
1.一种延缓细胞衰老的支架材料，其特征在于，所述支架材料为接枝有白藜芦醇的聚乳酸-己内酯支架材料。2.根据权利要求1所述的支架材料，其特征在于，所述支架材料为白藜芦醇通过羰基接枝于聚乳酸-己内酯支架材料。3.一种延缓细胞衰老的支架材料的制备方法，其特征在于，在聚乳酸-己内酯支架材料上接枝白藜芦醇。4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：S1.聚乳酸-己内酯支架材料进行丙烯酸修饰；S2.进行白藜芦醇接枝。5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，利用紫外光接枝法对聚乳酸-己内酯支架材料进行丙烯酸修饰。6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，以二苯甲酮为引发剂，利用紫外光接枝法对聚乳酸-己内酯支架材料进行丙烯酸修...

【专利技术属性】
技术研发人员：尤蓉，关燕清，石璐，陈素容，
申请(专利权)人：华南师范大学，
类型：发明
国别省市：广东,44