天然产物在激活斑点叉尾鮰核受体AHR1和AHR2活性中的应用制造技术

本发明专利技术研究了斑点叉尾鮰各组织中核受体AHR1和AHR2的表达水平，表达水平最高的组织为鳃，可作为筛选具有激活核受体AHR1和AHR2作用的天然产物的目标组织，采用从天然产物提取纯化的单体口灌斑点叉尾鮰后采集鳃，检测核受体AHR1和AHR2的表达情况，筛选出具有激活核受体AHR1和AHR2的配体——姜黄素及其相似物去甲氧基姜黄素、双去甲氧基姜黄素，经实验证实，姜黄素可使磺胺甲噁唑在斑点叉尾鮰可食组织中的残留量降低为原来残留量的2/5～7/10，残留时间由20 d缩短到15 d，因此，姜黄素及其相似物去甲氧基姜黄素、双去甲氧基姜黄素可用于加速斑点叉尾鮰体内磺胺类化学药物残留的消除。

Application of Natural Products in Activating the Nuclear Receptor AHR1 and AHR2 Activities of Channel Catfish

【技术实现步骤摘要】
天然产物在激活斑点叉尾鮰核受体AHR1和AHR2活性中的应用
本专利技术属于水产动物药理学
，具体涉及天然产物在激活斑点叉尾鮰核受体AHR1和AHR2活性中的应用，所述的天然产物包括姜黄素、去甲氧基姜黄素、双去甲氧基姜黄素。
技术介绍
斑点叉尾鮰(Ictaluruspunctatus)亦称美洲鲶、沟鲶，属鲶形目(Silurfornes)，鮰科(Ictaluridae)，是美国最重要的水产养殖鱼类之一。斑点叉尾鮰肉质鲜美、细嫩、营养丰富，且具有降血脂功效，深受广大消费者的喜爱。我国于1984年由湖北省首次从美国引进斑点叉尾鮰，经过近20年的养殖实践与研究，已逐步形成了一整套涵盖亲本培育、鱼卵孵化、苗种培育、成鱼饲养、饵料配制、鱼病防治等方面的完整技术体系。斑点叉尾鮰在养殖过程中养殖企业或养殖户为预防和治疗斑点叉尾鮰的疾病大量使用药物，进而在斑点叉尾鮰体内形成药物残留，通过食物链进入人体后对人体健康造成影响。药物残留问题已成为制约斑点叉尾鮰产业的健康发展的关键问题之一。目前很多受体都已经被证实是介导生物体药物代谢酶的关键因子，如核受体AHR能够在与核转运子ANRT形成二聚体的条件下对CYP1进行诱导。药物代谢酶与相关核受体在药物代谢和残留中起到关键作用。芳香烃受体(ArylHydrocarbonReceptor,AHR)也称二噁英受体，是调控外源毒性化合物代谢基因的关键核受体。通过二十多年的研究发现，除了作为外源物质的受体，参与代谢酶的转录调控。目前为止AHR基因家族至少有三个成员：AHR1、AHR2和AHRR(芳香烃受体抑制因子)。哺乳类和鸟类都只存在一个单一的AHR基因，而鱼类中却有两个不同的基因家系：AHR1(a1和a2)以及AHR2。鱼类AHR1基因缺乏与芳香烃化合物的高亲和力结合以及功能型激活区，没有与哺乳动物AHR类似的功能，鱼类AHR2基因具有与哺乳动物类似的功能。本专利技术对斑点叉尾鮰组织中核受体AHR1和AHR2的表达与分布进行分析，并对其具有激活功能的天然产物配体进行筛选，旨在为调控斑点叉尾鮰体内药物残留提供技术支撑，进而保障水产品的质量安全具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供了天然产物在激活斑点叉尾鮰核受体AHR1和AHR2活性中的应用，筛选出具有激活斑点叉尾鮰核受体AHR1和AHR2天然产物的配体——姜黄素、去甲氧基姜黄素、双去甲氧基姜黄素，并将其应用于加速消除斑点叉尾鮰体内磺胺类药物残留。为了达到上述目的，本专利技术采取以下技术措施：斑点叉尾鮰组织中核受体AHR1和AHR2的表达分布特征：研究了斑点叉尾鮰各组织中核受体AHR1和AHR2的表达水平，核受体AHR1在斑点叉尾鮰组织中表达分布由高到低排列为鳃、肾、脾、心、脑、肉、肝、皮，核受体AHR2在斑点叉尾鮰组织中表达分布由高到低排列为鳃、脾、肾、脑、心、肝、肌肉、皮，通过表达水平找出核受体表达水平最高的鳃组织，为后续开展筛选核受体活性激活天然产物提供技术基础和目标组织。斑点叉尾鮰核受体AHR1和AHR2激活配体天然产物单体的筛选：采用从天然产物提取纯化的单体口灌斑点叉尾鮰后，采集斑点叉尾鮰的各组织检测核受体AHR1和AHR2的表达情况，筛选出具有激活核受体AHR1和AHR2活性的天然产物单体姜黄素、去甲氧基姜黄素、双去甲氧基姜黄素。激活斑点叉尾鮰核受体AHR1和AHR2的天然产物单体在加速斑点叉尾鮰体内化学药物残留中的应用：经实验证实，姜黄素可使磺胺甲噁唑在斑点叉尾鮰可食组织中的残留量降低为原来残留量的2/5～7/10，残留时间由20d缩短到15d。因此，姜黄素及其相似物去甲氧基姜黄素、双去甲氧基姜黄素可用于加速斑点叉尾鮰体内磺胺类化学药物残留的消除，磺胺类药物包括磺胺甲噁唑、磺胺嘧啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲基异噁唑、磺胺甲噻二唑、磺胺噻唑、磺胺胍、磺胺喹噁啉。与现有技术相比，本专利技术具有以下优点和有益效果：(1)本专利技术首次研究了斑点叉尾鮰各组织中核受体AHR1和AHR2表达水平，通过表达水平找出核受体表达水平较高的组织作为筛选具有激活核受体AHR1和AHR2作用的天然产物的“目标组织”。(2)本专利技术筛选的具有激活斑点叉尾鮰核受体AHR1和AHR2天然产物单体作为核受体AHR1和AHR2的配体，激活后的核受体AHR1和AHR2调控(上调)细胞色素酶CYP1酶的活性，加速化学药物在斑点叉尾体内的残留消除。例如姜黄素单体可以使磺胺甲噁唑在斑点叉尾鮰带皮肌肉(可食组织)中的残留时间由20d缩短到15d，残留时间缩短了原来的1/4，同一时间点磺胺甲噁唑的残留量也明显降低。(3)本专利技术可使水产品中化学药物的残留时间缩短和残留量降低，对于保障水产品质量安全，减少人体摄入含有化学药物残留的水产品的风险具有重要意义。附图说明图1为引物筛选的琼脂糖凝胶电泳图。A泳道为筛选的核受体AHR1最佳引物AHR1-5F/5R，B泳道为筛选的核受体AHR2最佳引物AHR2-1F/1R，C泳道为引物AHR1-4F/4R，D泳道为引物AHR2-2F/2R，E泳道为引物AHR1-3F/3R，F泳道为引物AHR2-3F/3R，G泳道为引物AHR1-2F/2R，H泳道为引物AHR2-4F/4R，I泳道为引物AHR1-1F/1R，J泳道为引物AHR2-5F/5R。图2为斑点叉尾鮰各组织中核受体AHR1和AHR2的相对表达量。1-核受体AHR1在斑点叉尾鮰组织中的相对表达量，2-核受体AHR2在斑点叉尾鮰组织中的相对表达量。图3为姜黄素单体对应的斑点叉尾鮰带皮肌肉中磺胺甲噁唑残留消除规律(1-20d)。G-斑点叉尾鮰带皮肌肉中磺胺甲噁唑残留消除规律(3-20d)，1-口灌磺胺甲噁唑在斑点叉尾鮰带皮肌肉中残留消除规律；2-口灌筛选的具有激活核受体AHR1和AHR2的E对斑点叉尾鮰带皮肌肉中磺胺甲噁唑残留消除规律影响。具体实施方式实施例1斑点叉尾鮰组织中核受体AHR1和AHR2的表达分布特征：按照Trizol(Invitrogen)说明书提取斑点叉尾鮰肝脏、肾脏、皮、肌肉、脑、心、鳃、脾等组织RNA。将提取的斑点叉尾鮰各组织总RNA分别用DnaseI(Takara)处理后，用分光光度计检测所提RNA的浓度和质量(Aλ260/Aλ280)。利用反转录试剂盒PrimeScriptTMRTreagentKitwithgDNAEraser(PerfectRealTime)进行反转录合成cDNA第一链。引物的筛选：根据NCBIGenBank数据库公布的斑点叉尾鮰AHR1和AHR2基因的cDNA全长序列，通过Primer5.0、Primerquesttool以及生工生物工程在线设计，分别设计了五对特异性引物用于普通PCR以及实时定量PCR的扩增，设计的引物序列见表1。分别将上述设计的正引物1μL，反引物1μL，2×hieff12.5μL，DEPC水9.5μL，cDNA模板1μL，60℃反应1h。用1.5％琼脂糖电泳进行检测。以cDNA的合成量为筛选标准，筛选出核受体AHR1和AHR2最佳引物分别为AHR1-5F/5R、AHR2-1F/1R。核受体AHR1和AHR2的表达：用ABI7500荧光定量PCR仪进行斑点叉尾鮰肝脏、肾脏、皮、肌肉、脑、心、鳃、脾等组织器官的实时定量本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.天然产物在激活斑点叉尾鮰核受体AHR1和AHR2活性中的应用，其特征在于，所述的天然产物包括姜黄素、去甲氧基姜黄素、双去甲氧基姜黄素。

【技术特征摘要】
1.天然产物在激活斑点叉尾鮰核受体AHR1和AHR2活性中的应用，其特征在于，所述的天然产物包括姜黄素、去甲氧基姜黄素、双去甲氧基姜黄素。2.权利要求1所述的天然产物在加速消除斑点叉尾鮰体内磺胺类药物残留中的...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘永涛，王桢月，艾晓辉，曹翠宇，董靖，胥宁，杨秋红，杨移斌，
申请(专利权)人：中国水产科学研究院长江水产研究所，
类型：发明
国别省市：湖北,42