一种戊型肝炎亚单位疫苗制造技术

本发明专利技术提供一种戊型肝炎亚单位疫苗，其中抗原蛋白时氨基酸序列为SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的戊型肝炎病毒ORF2蛋白。本发明专利技术的戊型肝炎ORF2蛋白制备的亚单位疫苗具有抗原稳定性高，纯度高，特异性强，不产生其他不相关抗体，检测方法方便准确的特点，为工业化生产戊型肝炎疫苗和诊断试剂奠定了坚实的基础。

A Subunit Vaccine for Hepatitis E

【技术实现步骤摘要】
一种戊型肝炎亚单位疫苗
本专利技术属于兽用生物制品
，具体涉及一种戊型肝炎亚单位疫苗。
技术介绍
戊型肝炎是由戊型肝炎病毒(HepatitisEVirus，HEV)引起的以肠道传播为主的传染性疾病，具有急性病毒性肝炎的临床和流行病学特征,是一种经肠道传播的严重危害人类健康的病毒性肝炎。目前戊型肝炎在我国以及许多发展中国家中流行，在少数发达国家呈散发性流行。HEV是一种人畜共患病毒，已有报道显示HEV在自然条件下能感染鸡、鹿和兔等多种动物。戊型肝炎在一些爆发性发病鸡群中会使产蛋率下降20％以上。产蛋肉种鸡和30～72周龄产蛋母鸡HS综合征死亡率比正常死亡率高，40～50周龄发病率最高。病鸡可能出现鸡冠、肉垂苍白、沉郁、食欲不振、肛门口羽毛污染或有糊状粪便。现有的戊型肝炎疫苗为传统疫苗，是使用完整的病原体作为制苗用抗原。传统的灭活疫苗具有独特的优势如免疫后抗体均一，抗体效价高，但也存在制造疫苗使用的毒株培养困难，与临床流行毒株的抗原性存在较大差异，从而影响了攻毒保护效果的缺点，从而制约了灭活疫苗的应用。而且，使用全病毒抗原制备的传统疫苗免疫后产生的抗体，在临床上无法区分野毒感染或是疫苗免疫产生，会导致干扰疫情的监测。为解决传统疫苗的问题，就需要筛选新的毒株或者开发新的亚单位疫苗以克服现有疫苗的问题。
技术实现思路
本专利技术目的是提供一种戊型肝炎亚单位疫苗，从而弥补现有技术的不足。本专利技术提供一种亚单位疫苗，包含有抗原和疫苗佐剂，其中抗原是戊型肝炎病毒ORF2蛋白；其中ORF2蛋白的氨基酸序列为SEQIDNO:2；更优选的，所述的ORF2蛋白的氨基酸序列为SEQIDNO:4，编码基因的核苷酸序列为SEQIDNO:3；本专利技术使用的戊型肝炎病毒ORF2蛋白，是使用重组大肠杆菌发酵制备的；更进一步的，本专利技术的ORF2蛋白进行了灭活处理；具体是使用甲醛溶液进行灭活；本专利技术所提供的亚单位疫苗的制备方法，包括如下的步骤：1)油相制备：取兽用白油95份，硬脂酸铝1份，置于油相制备罐中加热至80℃后，再加5份司本-80，至温度达到115℃时，维持30min，冷却后备用；2)水相制备：将大肠杆菌表达的ORF2蛋白使用生理盐水稀释成30μg/0.2ml，配成制苗用抗原液；取灭菌后的5份吐温-80，加入配液罐中，同时加入抗原液95份，搅拌20～30min，使吐温-80完全溶解；3)乳化：取油相2份放于高速剪切机内，开动电机慢速转动搅拌，同时徐徐加入水相1份，以10000r/min，乳化5分钟完成制备。本专利技术的戊型肝炎ORF2蛋白制备的亚单位疫苗具有抗原稳定性高，纯度高，特异性强，不产生其他不相关抗体，检测方法方便准确的特点，为工业化生产戊型肝炎疫苗和诊断试剂奠定了坚实的基础。具体实施方式本专利技术从全国各地临床发生戊型肝炎的养殖场分离HEV，并对其临床流行病学和遗传变异进行分析，筛选到一株免疫原性好的戊型肝炎病毒(QD07株)，从中获得了一种新型的戊型肝炎病毒抗原蛋白(ORF2蛋白)，将其在大肠杆菌中获得进行可溶性的表达，制备亚单位疫苗。下面结合具体实施例对本专利技术进行详细的说明。实施例1：ORF2基因的扩增及序列分析2018年自大连地区的部分肉种鸡发生疑似戊型肝炎，经临床调查和实验室检测，初步诊断为戊型肝炎。经调查上述的发病鸡群之前已经注射过戊型肝炎疫苗，也做过中和抗体的检测。怀疑有戊型肝炎病毒在疫苗的选择压力下发生了突变，从发病鸡病料样品中分离出戊型肝炎病毒QD07株，作为扩增的模板。1、扩增戊型肝炎病毒ORF2基因根据NCBI中发表的戊型肝炎病毒ORF2基因序列，设计并合成了引物,引物的序列信息如下：primer1：5′-ATGTCGGTGCGTGGATTGTTGCTC-3′；primer2：5′-CTAGGGTGGTGAGGGAAACGT-3′。提取分离的病毒的核酸作为模板，用引物primer1和primer2进行PCR扩增目的片段，经序列测定核苷酸序列为SEQIDNO:1，编码蛋白的氨基酸序列为SEQIDNO:2。与NCBI中已公布的戊型肝炎病毒ORF2基因进行核苷酸序列比对分析，结果核苷酸同源性约为83.4％～91.7％；推导的氨基酸第39位(Q变H)、198位(Y变F)、240位(G变P)、294位(T变A)、306位(D变E)、317位(L变I)、398位(S变T)、442位(A变D)、468位(T变N)、506位(F变I)发生变异，氨基酸序列同源性分析约为78.6％～97.1％。结果表明，分离的病毒为新的戊型肝炎病毒，含有新的ORF2基因。2、优化并合成戊型肝炎病毒ORF2基因分析所获得的戊型肝炎病毒ORF2基因的抗原特性，将ORF2基因的结构域进行剪切，将N端330aa剪切掉，把C端5aa剪切掉，并将N端加入3个脯氨酸3个精氨酸，帮助蛋白进行空间折叠和进行可溶性表达，同时将C(剪切修饰后的第61位、255位、256位)突变为R来帮助蛋白进行可溶性表达，表达出具有正确空间结构的蛋白，将其抗原位点更好地暴露出来。优化修饰后的氨基酸的序列为SEQIDNO:4，能很好地表达出抗原位点。通过以上的优化突变达到蛋白在大肠杆菌内的可溶性表达。设计合成用于ORF2蛋白表达的核苷酸序列为SEQIDNO:3，送上海生物工程有限公司公司合成后为模板，用引物primer3和primer4进行PCR扩增，目的片段产物回收连接pMD18-T载体，转化和筛选阳性克隆pMD18-T-ORF2。引物primer3和primer4的序列信息如下：primer3：5′-TTGAATTCCCCCCGCCGAGAAGAAGGA-3′；primer4:5′-AAGCGGCCGCCTACGTCCTACTAAGCCG-3′。实施例2：戊型肝炎病毒ORF2蛋白的重组表达1.ORF2蛋白的制备方法包括以下步骤：a.构建表达载体；b.构建表达菌株；c.重组ORF2蛋白的诱导和提取纯化。a.构建表达载体：将阳性克隆质粒pMD18-T-ORF2和表达载体pET28a载体分别用EcoRI和NotI双酶切产物经1.2％琼脂糖凝胶电泳后,用DNA凝胶回收试剂盒回收,分别获得约5400bp和850bp片段,在16℃定向连接构建pET28a表达载体；测序验证序列和读码框无误后,将质粒线性化后，转化入BL21感受态细胞。b.构建表达菌株、蛋白提取纯化：转化后，37℃培养18h。挑取单菌落于LB液体培养基(含卡那霉素)中，37℃摇床振荡培养16小时后，10000r/min离心5min，收集菌体后，用沸水浴煮5min，12000r/min离心2min离心取上清作为模板，进行PCR鉴定,PCR反应条件：94℃预变性5min；94℃1min，55℃1min，72℃1min，共进行32个循环；72℃10min。PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测，可以扩增出约850bp条带。检测结果表明，含ORF2基因的重组质粒成功转入BL21感受态细胞。将PCR检测阳性的菌株分别接种30mLLB培养基中，37℃摇床培养至OD600＝0.6,加入IPTG至终浓度1mmol/L，诱导6h,培养物离心后用1/20体积的PBS重悬，破碎后，离心取上清进行SDS-PAGE检测。同时，将没有改造前的基因(即含SE本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种亚单位疫苗，其特征在于，所述的亚单位疫苗包含有抗原和疫苗佐剂，抗原是戊型肝炎病毒ORF2蛋白；其中ORF2蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:2。

【技术特征摘要】
1.一种亚单位疫苗，其特征在于，所述的亚单位疫苗包含有抗原和疫苗佐剂，抗原是戊型肝炎病毒ORF2蛋白；其中ORF2蛋白的氨基酸序列为SEQIDNO:2。2.如权利要求1所述的亚单位疫苗，其特征在于，所述的ORF2蛋白的氨基酸序列为SEQIDNO:4。3.如权利要求2所述的亚单位疫苗，其特征在于，所述的ORF2蛋白的编码基因的核苷酸序列为SEQIDNO:3。4.如权利要求1所述的亚单位疫苗，其特征在于，所述的戊型肝炎病毒ORF2蛋白是使用重组大肠杆菌发酵制备的。5.如权利要求1所述的亚单位疫苗，其特征在于，所述的戊型肝炎病毒ORF2蛋白进行了灭活处理。6.如权利要求5所述的亚单位疫苗，其特征在于，所述的戊...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭伟伟，向银辉，蔡联燊，刘新文，刘义，范根成，杜元钊，
申请(专利权)人：青岛易邦生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：山东,37