一种用于米糠脂肪酶的制备方法技术

本发明专利技术公开一种用于米糠脂肪酶的制备方法，包括：萃取步骤及纯化步骤，萃取步骤中，将米糠加入酵素萃取溶液中搅拌，予以离心后得到米糠脂肪酶酵素萃取液，在纯化步骤中，将米糠脂肪酶酵素萃取液，加入硫酸铵暨酒精中搅拌，得到米糠脂肪酶纯化酵素沉淀。本发明专利技术的功效在于，利用硫酸铵及酒精共沉淀进行酵素纯化，可以有效地提升米糠脂肪酶制备效率及缩短米糠脂肪酶生产制程，且经过放大规模验证，证实本发明专利技术可以应用于商业化生产米糠脂肪酶。

A Method for Preparing Rice Bran Lipase

【技术实现步骤摘要】
一种用于米糠脂肪酶的制备方法
本专利技术公开一种用于米糠脂肪酶的制备方法，其包括：米糠脂肪酶的萃取及纯化制程，从而取得米糠脂肪酶纯化酵素。
技术介绍
目前米糠多被当作低价动物饲料使用，虽然米糠是种农业废弃物，但其含有很多营养价值，包括：膳食纤维、胺基酸组成均衡、脂肪酸组成均衡、玄米油、富含维生素E、富含维生素B群及矿物质、植物固醇类、阿魏酸、γ-米糠醇。虽然米糠具有如此多元化的营养价值，但其利用率并不高。此外，米糠有油脂酸败的缺点，且容易滋生微生物，所以保存不易。米糠酸败的原因主要来自于米糠本身含有的一种酵素作用，所述酵素称为脂肪酶(lipase)，米糠脂肪酶主要存在于米皮中，在未与脂肪接触时并不会产生作用。但是当自米皮碾下成米糠后，会导致脂肪酶与油脂发生接触，使脂肪酶酵素活性迅速提升，并开始降解脂肪释放出游离脂肪酸，进而造成油脂氧化性酸败，最终导致米糠发生酸败变质(中国专利CN102279166A)。所以对于米糠而言，脂肪酶的存在不利于米糠保存及后续利用。但是，脂肪酶除了可降解酯键释放出脂肪酸外，它还含有许多酵素活性，例如转酯化活性，可用于生质柴油制程。与传统化学反应相比较，脂肪酶的反应条件温和，并具有良好的受质立体选择性(可用于药物制备)，且对环境友善不会造成污染，因此脂肪酶广泛应用于食品、皮革、医药、饲料及清洁等工业领域中。在工业酵素市场方面，2014年全球市场产值达42亿美元，其特征在于脂肪酶约占整体市场10％。就脂肪酶市场分析，预估2020年全球市场将达近6亿美元，2015～2020年间的年成长率可达6.5％，主要用途为清洁工业及食品工业，主要市场以亚洲最大。全球多间企业以酵素切入工业酵素市场，使用的酵素种类以脂肪酶为主，脂肪酶相关产品的用途为生物性催化剂及油污清洁剂，酵素来源为微生物(真菌)及油污分解菌(Bacillussp.)。中国专利CN103642771B揭示一种米糠脂肪酶的粗酶提取及保存方法，所述方法包括：第一步进行米糠脱脂作用，按每1g米糠对应3mL正己烷的比例进行，混匀后震荡(170-190rpm)处理25至35分钟，尔后经过充分过滤将滤渣内米糠颗粒取出，于常温下放置4至8小时，每1小时搅拌3至4次以使正己烷充分挥发；第二步进行脱脂米糠脂肪酶的提取，将充分干燥的脱脂米糠颗粒，按每1g脱脂米糠对应8mL蒸馏水的比例进行，混匀后震荡(170-190rpm)处理25至35分钟，再于低温下(2-6℃)离心(2,000-4,000rpm)处理25至35分钟后，取离心上清液即为米糠脂肪酶的粗酶提取液；最后一步进行米糠脂肪酶粗酶保存，将粗酶提取液制成冷干粉或以含有0.5mM氯化钙的磷酸缓冲液(50mM,pH7.0)进行保存。相较于传统磷酸缓冲液研磨提取法，本专利使用蒸馏水震荡法进行米糠脂肪酶的提取，所提取米糠脂肪酶粗酶的比活性较高且纯度好，所述方法操作简单且耗时较短。然所得粗酶未进一步进行纯化以取得纯度较高的脂肪酶。世界专利组织专利WO02/101033A1揭示一种米糠脂肪酶的纯化方法，所述方法包括：第一步进行米糠脱脂作用，按每1g米糠对应10mL乙醚的比例进行米糠脱脂；第二步进行脱脂米糠脂肪酶的提取，将脱脂米糠颗粒置入含有1mMEDTA的Tris-HCl缓冲液(10mM,pH7.5)，搅拌处理12小时后，通过多层棉布过滤，所得滤液通过离心(3,000×g)处理30分钟后，取离心上清液即为米糠脂肪酶的粗酶提取液；最后一步进行米糠脂肪酶粗酶提取液的纯化，使用octyl-Sepharose管柱(预先以pH7.5的0.01MTris-HCl缓冲液进行平衡)对米糠脂肪酶粗酶提取液进行纯化，并利用0至40％甲醇进行线性梯度溶离(一个溶离液分划收集量为10mL)，纯化米糠脂肪酶存在于较后期溶离出来的溶离液。最终纯化倍率为6.8倍，活性回收率为20％。本专利虽可取得纯度高的米糠脂肪酶并进行相关详尽的酵素特性分析，然制程复杂、费时且操作危险(使用乙醚进行米糠脱脂)，专利内容偏向学术研究，不利于商业化生产米糠脂肪酶。由以上专利整理得知，CN103642771B虽揭示一种操作简单且耗时较短的米糠脂肪酶提取方法，然所得米糠脂肪酶为粗酶，未进一步纯化取得纯度较佳的脂肪酶；而WO02/101033A1虽揭示一种详细的米糠脂肪酶纯化方法，然使用制程复杂、费时且危险(使用乙醚)，不利于商业化生产大量米糠脂肪酶。由此可知，截至目前为止，米糠脂肪酶的大量生产制程技术未臻完善，因此，若能发展出具有良好酵素萃取纯化效率、简易操作程序以及低成本的新式米糠脂肪酶制备制程，会是吾人所期望达成的。所以本专利技术提出的米糠脂肪酶的萃取及纯化制程，非常符合专利申请新颖性与进步性特点，具有专利可行性。
技术实现思路
因此，本专利技术的目的在于，提高米糠脂肪酶的萃取及纯化效率，进而能利用米糠脂肪酶来进行高值化的酵素相关产品开发。本专利技术一种米糠脂肪酶的制备方法，其包括萃取步骤及纯化步骤，萃取步骤：将米糠加入酵素萃取溶液中搅拌，予以离心后得到米糠脂肪酶酵素萃取液，纯化步骤：将米糠脂肪酶酵素萃取液，加入硫酸铵暨酒精中搅拌，得到米糠脂肪酶纯化酵素沉淀。本专利技术米糠脂肪酶的制备方法，其中，米糠是未脱脂米糠。本专利技术米糠脂肪酶的制备方法，其中，萃取步骤中，米糠：酵素萃取溶液的比例为1:2以上。本专利技术米糠脂肪酶的制备方法，其中，萃取步骤中，米糠：酵素萃取溶液的比例为1:4。本专利技术米糠脂肪酶的制备方法，其中，萃取步骤中，酵素萃取溶液是含有表面活性剂的蒸馏水。本专利技术米糠脂肪酶的制备方法，其中，萃取步骤中，酵素萃取溶液是含有表面活性剂为0.1％TritonX-100的蒸馏水。本专利技术米糠脂肪酶的制备方法，其中，纯化步骤分为两阶段进行，第一阶段纯化步骤：将米糠脂肪酶酵素萃取液加入硫酸铵搅拌，得到纯化第一阶段完成的米糠脂肪酶酵素溶液，第二阶段纯化步骤：将纯化第一阶段完成的米糠脂肪酶酵素溶液，加入酒精搅拌后静置，得到米糠脂肪酶纯化酵素沉淀。本专利技术米糠脂肪酶的制备方法，其中，酒精浓度为20％以上。本专利技术米糠脂肪酶的制备方法，其中，酒精浓度为50％。本专利技术一种米糠脂肪酶的制备方法，其中，其包括萃取步骤及纯化步骤，萃取步骤：将米糠加入酵素萃取溶液中搅拌，酵素萃取溶液是含有表面活性剂的蒸馏水，予以离心后得到米糠脂肪酶酵素萃取液，纯化步骤：将米糠脂肪酶酵素萃取液，加入硫酸铵暨酒精中搅拌，得到米糠脂肪酶纯化酵素沉淀。本专利技术的功效在于，利用硫酸铵及酒精共沉淀进行酵素纯化，有别于公知采分段式步骤处理(通过硫酸铵沉淀步骤及酒精沉淀步骤)，可以有效地提升米糠脂肪酶制备效率及缩短米糠脂肪酶生产制程，且经过放大规模验证，证实本专利技术可以应用于商业化生产米糠脂肪酶。附图说明图1是本专利技术的米糠脂肪酶的制备方法的流程示意图。图2是脂肪酶标准品的脂肪酶酵素活性检量线。图3是牛血清白蛋白标准品的蛋白质浓度检量线(蛋白质浓度分析方法一)。图4是牛血清白蛋白标准品的蛋白质浓度检量线(蛋白质浓度分析方法二)。附图标记:<本专利技术>1萃取步骤2纯化步骤21纯化步骤第一阶段22纯化步骤第二阶段具体实施方式本专利技术的上述以及其它目的、特征与优点，在参照以下的详细说明与较佳实施例和随文检附的图式后，将变得明显。参阅图1本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种米糠脂肪酶的制备方法，其特征在于，包括：萃取步骤：将米糠加入酵素萃取溶液中搅拌，予以离心后得到米糠脂肪酶酵素萃取液；及纯化步骤：将米糠脂肪酶酵素萃取液，加入硫酸铵暨酒精中搅拌，得到米糠脂肪酶纯化酵素沉淀。

【技术特征摘要】
2018.11.27 TW 1071421611.一种米糠脂肪酶的制备方法，其特征在于，包括：萃取步骤：将米糠加入酵素萃取溶液中搅拌，予以离心后得到米糠脂肪酶酵素萃取液；及纯化步骤：将米糠脂肪酶酵素萃取液，加入硫酸铵暨酒精中搅拌，得到米糠脂肪酶纯化酵素沉淀。2.根据权利要求1的米糠脂肪酶的制备方法，其特征在于，米糠是未脱脂米糠。3.根据权利要求1的米糠脂肪酶的制备方法，其特征在于，萃取步骤中，米糠：酵素萃取溶液的比例为1:2以上。4.根据权利要求3的米糠脂肪酶的制备方法，其特征在于，萃取步骤中，米糠：酵素萃取溶液的比例为1:4。5.根据权利要求1的米糠脂肪酶的制备方法，其特征在于，萃取步骤中，酵素萃取溶液是含有表面活性剂的蒸馏水。6.根据权利要求5的米糠脂肪酶的制备方法，其特征在于，萃取步骤中，...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈劲中，高国展，高艾玲，蔡昌廷，郑新耀，蔡承佳，
申请(专利权)人：台湾中油股份有限公司，
类型：发明
国别省市：中国台湾,71