一种固定化甘醇酸氧化酶催化合成丙酮酸的方法技术

本发明专利技术公开了一种固定化甘醇酸氧化酶催化合成丙酮酸的方法，包括如下步骤：配置L‑乳酸水溶液，调节L‑乳酸水溶液的pH值为8.5～9.5，加入过氧化氢酶、辅酶及固定化甘醇酸氧化酶，在5‑30℃下通入空气或氧气进行反应。本发明专利技术采用固定化甘醇酸氧化酶、结合常压下催化制备丙酮酸，实现从L‑乳酸到丙酮酸的高效转化。

A method for synthesis of pyruvate catalyzed by immobilized glycolic acid oxidase

【技术实现步骤摘要】
一种固定化甘醇酸氧化酶催化合成丙酮酸的方法
本专利技术涉及一种制备丙酮酸的方法，特别涉及到一种酶法制备丙酮酸的方法，属于微生物

技术介绍
丙酮酸是最重要的有机酸之一，在制药、食品、化工、农用化学品等领域以及科学研究中具有广泛的用途。与丙酮酸结构相关的化合物高达94434个，其中丙酮酸及许多氨基酸可以分别用作减肥保健药品、氨基酸类药物、营养增补剂、医药合成中间体等，其需求总量巨大。目前工业化生产丙酮酸的方法主要为化学合成法。酶法兼具技术潜力和环保优势，尤其是以乳酸为原料的生物催化合成丙酮酸工艺，是国际上普遍看好的可取代化学法的工艺。与化学合成方法和发酵法相比，酶转化法反应条件温和具有环境和劳动保护上的自然优势；反应组分简单明确，分离提取易于实施。乳酸是符合上述要求的最有前景的起始原料，其成本与酒石酸接近，但分子量比酒石酸小，相同摩尔转化率情况下原子利用率高于酒石酸。同时乳酸易于发酵制备，生产工艺与市场皆成熟，是大宗化学品新工艺商业化运行的有力保障。已报道的可用于乳酸到丙酮酸转化的酶有乳酸脱氢酶、乳酸氧化酶和甘醇酸氧化酶。乳酸脱氢酶虽然收率较高，但反应浓度和效率都不高，且菌体需要量大，菌体反应中产物提取困难，并无后续报道。乳酸氧化酶和甘醇酸氧化酶需要FAD/FMN作为辅酶，反应产生过氧化氢。采用乳酸氧化酶进行乳酸氧化制造丙酮酸的报道均以细菌作为酶来源，且以国内学者的工作为主，但报道的技术水平均不高，也无后续的进展。甘醇酸氧化酶GO(2-hydroxyacidoxidase,EC1.1.3.15)是一个黄素单核苷酸FMN依赖的过氧化物酶，可催化2-羟基酸如乳酸和乙醇酸的转化得到相应的2-酮酸。1996和1997年，专利和文章(US5538875,1996；JournalofMolecularCatalysisBEnzymatic,1997,2(4):223-232)报道，采用酵母细胞表达甘醇酸氧化酶及过氧化氢酶。以透性化处理的细胞反应，在5℃、70～120psig条件下转化，丙酮酸浓度可达到89.3g/L，转化率在96-86.1％之间，菌体可以反复利用5次。2005年，S.Gough等(ProcessBiochemistry,2005,40(8):2597-2601)也利用毕赤酵母共表达菠菜GO和CAT，在全细胞转化中，转化率可以达到接近100％即44g/L。2010ShuvenduDas等(BiotechnologyProgress,2010,26(3):607-615)利用表达菠菜GO和CAT的重组毕赤酵母，进行DL-乳酸的拆分，其中L-乳酸可以被转化为丙酮酸，而D-乳酸则基本不被转化；利用60g/L冻融透性化菌体转化为丙酮酸，转化率93％，时空转化效率为10.14g/L/h，折合反应液中丙酮酸浓度为24.5g/L。这些报道中虽然丙酮酸具有较高的转化水平，但其反应体系中细胞成分、培养基成分对提取影响较大，提取难以实现，产业化应用未见报道；同时反应需要在高压下进行，否则丙酮酸浓度较低。
技术实现思路
本专利技术提供一种酶法制备丙酮酸的方法，采用固定化甘醇酸氧化酶、结合常压下催化制备丙酮酸，实现从L-乳酸到丙酮酸的高效转化。一种固定化甘醇酸氧化酶催化合成丙酮酸的方法，包括如下步骤：配置L-乳酸水溶液，调节L-乳酸水溶液的pH值为8.5～9.5，加入过氧化氢酶、辅酶及固定化甘醇酸氧化酶，在5-30℃下通入空气或氧气进行反应。乳酸可以配制成钠盐、钾盐、铵盐等形式，如L-乳酸水溶液调节pH时用氢氧化钠即为钠盐，用氨水时为铵盐，用氢氧化钾时为钾盐。或者直接用购买的各种乳酸盐。过氧化氢酶用于消除反应产生的过氧化氢，可以是商品化的过氧化氢酶液，或其他固定化的过氧化氢酶等形式；反应所需的氧通过空气或氧气形式提供。优选地，L-乳酸水溶液的浓度为50g/L～300g/L，优选100～150g/L；固定化甘醇酸氧化酶的加入量为10g/L～200g/L；优选50～150g/L。优选地，辅酶为黄素单核苷酸FMN、加入量为0.8～1.2mmol/L；过氧化氢酶加入量为10mL/L～25mL/L。优选地，固定化甘醇酸氧化酶的甘醇酸氧化酶采用菠菜甘醇酸氧化酶；菠菜甘醇酸氧化酶的基因序列如SEQNo.1所示。甘醇酸氧化酶优选带有His-tag的菠菜甘醇酸氧化酶。固定化方法为常规的方法，如载体结合法、共价交联法等，优选地，固定化甘醇酸氧化酶的固定化载体采用金属螯合固定化载体，如用Ni离子或钴离子活化的LX-1000IDA、SepliteLX-1000IDA或FP-IDA405/EB等，进一步优选例如树脂LX-1000IDA，该载体为市售产品，可市购获得。甘醇酸氧化酶通过常规基因工程方法由微生物进行发酵并提取得到。优选以大肠杆菌作为表达宿主菌。固定化方法为业内常规方法，包括吸附法、包埋法、共价结合法、交联法等，其中优选金属亲和固定化法。优选地，还包括固定化甘醇酸氧化酶回收利用步骤：反应结束后，将所述固定化甘醇酸氧化酶分离，用于下一轮反应。固定化酶重复使用反应结束后离心或过滤，得到的固定化酶用于新的丙酮酸反应。优选地，反应所需的氧的提供形式为：先将反应体系以空气或氧气饱和，反应过程中数次置换新空气或新氧气。与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：Eisenberg等(JournalofMolecularCatalysisBEnzymatic,1997,2(4):223-232.)认为游离酶不利于乳酸向丙酮酸的转化；文献报道中的反应多需要在高压下以细胞酶或者发酵液中进行，以纯化酶进行反应，可以避免发酵液或细胞中的过多杂质组分给分离纯化带来的难度。现有文献中有利用固定化细胞进行丙酮酸生物反应的报道，但利用固定化酶尚未见报道，其原因是一般认为液体酶对氧的传质效果要优于固体酶，且固定化酶做丙酮酸反应不利于传氧。而本专利技术研究中发现固定化酶结合常压催化的反应其效率高于液体酶，并且固定化酶可以重复使用，避免非固定化酶反应中需要加压的条件，给反应的安全性提供了更好的保障，也便于工业生产中成本的下降。具体实施方式下面通过具体实施例，对本专利技术的技术方案作进一步具体的说明，但是本专利技术并不限于这些实施例。实施例1TB培养基的配制：在5L发酵罐中加入酵母抽提物72g，蛋白胨36g，甘油12g，水2L，磷酸二氢钾5g，磷酸氢二钾6g，121℃灭菌20min，冷却至37℃，得到相应的TB培养基。将30mL含有T7启动子和表达重组甘醇酸氧化酶(SEQNO.1)的重组大肠杆菌菌种接入到TB培养基中，然后，控制温度在37℃下通气搅拌活化培养2h后，将温度降到25℃，再加入含有20wt％乳糖的乳糖溶液225mL，继续升温控制温度在37℃进行发酵培养至24h，培养结束后发酵得到相应的发酵液3L。离心收集菌体，-20℃保存备用。取上述得到的菌体100g，以1.0L50mmol/L且pH值为7.0的磷酸钾缓冲液进行重悬，而后经高压均质破壁2遍后得到相应的破壁酶液，再经10000rpm离心10min，得到待用酶液。实施例2取20g新载体LX-1000IDA，加入200mLpH8.050mMEDTA缓冲液，室温震荡1h后过滤，以100mL0.5MNaCl分两次重悬并过滤洗掉残留的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种固定化甘醇酸氧化酶催化合成丙酮酸的方法，其特征在于，包括如下步骤：配置L‑乳酸水溶液，调节L‑乳酸水溶液的pH值为8.5～9.5，加入过氧化氢酶、辅酶及固定化甘醇酸氧化酶，在5‑30℃下通入空气或氧气进行反应。

【技术特征摘要】
1.一种固定化甘醇酸氧化酶催化合成丙酮酸的方法，其特征在于，包括如下步骤：配置L-乳酸水溶液，调节L-乳酸水溶液的pH值为8.5～9.5，加入过氧化氢酶、辅酶及固定化甘醇酸氧化酶，在5-30℃下通入空气或氧气进行反应。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，L-乳酸水溶液的浓度为50g/L～300g/L；固定化甘醇酸氧化酶的加入量为10g/L～200g/L。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，固定化甘醇酸氧化酶的甘醇酸氧化酶...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈潭，杨仲毅，陈良明，陶宇翔，吴智超，陈永江，石晓梦，许殷铭，
申请(专利权)人：台州学院，
类型：发明
国别省市：浙江,33