抗松针褐斑病湿地松胚性愈伤组织的超低温保存方法技术

本发明专利技术公开了抗松针褐斑病湿地松胚性愈伤组织的超低温保存方法。通过适当的预培养与采用混合型冷冻保护剂有助于提升超低温保存效果，经32℃解冻后，冷冻90d的愈伤组织1个月后可恢复再生，胚性愈伤组织的再生率最高达100％，再生愈伤组织生长状态良好并依然保持分化成熟体胚的能力。本申请初步建立了抗松针褐斑病湿地松胚性愈伤组织的超低温保存体系，为抗性湿地胚性愈伤组织胚性的长期维持提供了技术参考。

Cryopreservation of Embryogenic Callus of Pinus elliottii Resistant to Pine Needle Brown Spot Disease

【技术实现步骤摘要】
抗松针褐斑病湿地松胚性愈伤组织的超低温保存方法
本专利技术涉及植物愈伤组织的保存，具体涉及抗松针褐斑病湿地松胚性愈伤组织的超低温保存方法。
技术介绍
湿地松(Pinuselliottii)为松科松属的速生常绿乔木，原产于美国东南部，是我国南方重要造林绿化树种。1978年起，松针褐斑病在我国南方引种的湿地松上陆续发生，严重限制了湿地松的发展(李传道等，1987)。因此，开展湿地松抗病育种研究具有极为重要的经济意义与生态意义。1986年，叶建仁等在福建建立了湿地松抗病种子园，但传统育种方法难以在短期内达到规模化量产的要求(叶建仁等，1991)。植物组织培养技术为快速大量繁殖优良抗病基因型以在短周期内实现生产增益提供了捷径(黄健秋和卫志明，1994)。其中，体细胞胚胎发生具有数量多、速度快、结构完整、再生率高等优点，成为松属树种离体组织培养的常用方法(黄健秋和卫志明，1995)。前期研究中，程芳(2010)、戴蓓(2014)、张彩云(2016)、方珞(2018)等针对抗松针褐斑病湿地松体细胞胚胎发生植株再生途径进行了大量研究，获得了不同家系的胚性愈伤组织。由于胚性愈伤组织的长期继代易造成体细胞变异并导致其胚性丧失，因此筛选可靠长久的低温保存方法至关重要(Ulrichetal.，1979；Mustafaetal.，2011；王艳丽等，2019)。超低温冷冻保存是利用植物在超低温环境下，细胞中各种生物酶类的活性受到环境抑制，其新陈代谢几乎停止，而恢复到常温环境下又能正常进行生长发育的原理，从而实现种质资源的长期保存(Kaviani，2011)。通常需要根据不同的植物材料来选择不同的冷冻处理程序，主要包括慢速冷冻法或两步冷冻法，包埋-干燥法、玻璃化法和滴冻法(Reinhoudetal.，2000)，其中慢速冷冻法最常用来保存针叶树胚胎培养物。1988年Kartha(1988)等通过慢速冻结法成功冷冻保存了青海云杉细胞悬浮培养物，此方法已成功运用于多种针叶树种包括火炬松(Pinustaeda)、挪威云杉(Piceaabies)(Guptaetal.，1987)、红豆杉(Taxuscuspidate)(叶芳等，2001)、红松(PinuskoraiensisSieb.etZucc)(王高等，2009)、欧洲黑松(Pinusnigra)(Salajetal.，2012)、湿加松(PinuselliottiixP.caribaea)(Nunesetal.，2017)和辐射松(Pinusradiate)(Linerosetal.，2018)等树种的超低温保存。本申请在前人研究的基础上对影响湿地松胚性愈伤组织超低温保存的各种因素进行探究，旨在建立一个长期有效的冷冻保存程序，为抗性湿地松胚性愈伤组织胚性的长期维持提供技术参考。
技术实现思路
专利技术目的：针对上述现有技术中存在的问题，本专利技术的目的是提供一种抗松针褐斑病湿地松胚性愈伤组织的超低温保存方法，以期建立适宜抗松针褐斑病湿地松胚性愈伤组织的超低温保存体系，为抗性湿地胚性愈伤组织胚性的长期维持提供了技术参考。技术方案：为了实现上述专利技术目的，本专利技术采用的技术方案为：抗松针褐斑病湿地松胚性愈伤组织的超低温保存方法，包括以下步骤：1)湿地松细胞系的胚性愈伤组织置于含有蔗糖的增殖培养基中预培养；2)预培养后的胚性愈伤组织置于冷冻管中，加入冷冻保护剂，进行程序降温，温度降至-80℃后取出冷冻管并迅速投入液氮，进行超低温保存；其中，冷冻保护剂的组分和浓度为：DMSO浓度为2.5～15％，蔗糖浓度为0～0.6mol/L，PEG4000浓度为0～15％，蔗糖和PEG4000的组分浓度不同时为0；3)使用时，取超低温保存胚性愈伤组织水浴条件下进行解冻，待冰完全溶化后立即将冷冻管取出。步骤1)中，湿地松细胞系为湿地松27-1系。步骤1)中，预培养时间为12～48h。进一步的，步骤1)中，预培养时间为36h。步骤2)中，冷冻保护剂的组分和浓度为：DMSO浓度为5％，蔗糖浓度0.5mol/L，PEG4000浓度为15％。步骤2)中，将加入冷冻保护剂的冷冻管置于程序降温盒中，先从室温降至0℃，然后以-1℃/min的速率降温至-80℃，-80℃保存30分钟后立即投入液氮罐中保存。步骤3)中，解冻温度为32℃～40℃。进一步的，步骤3)中，解冻温度为32℃。步骤3)中，胚型愈伤组织解冻后，恢复培养和成熟分化培养条件为：培养温度23±2℃，暗培养；增殖培养基为LP+1.0mg/LNAA+0.3mg/L6-BA+0.3mg/L6-BA+15g/L麦芽糖+6.5g/L琼脂，pH＝5.8；成熟培养基为LP+10mg/LNAA+130g/LPEG8000+60g/L麦芽糖+3g/L植物凝胶，pH＝5.8。步骤1)中，蔗糖浓度为0.5mol/L。有益效果：与现有技术相比，本专利技术通过适当的预处理与采用混合型冷冻保护剂有助于提升超低温保存效果。继代培养10-12d生长状态良好的愈伤组织，在添加0.5mol/L蔗糖的高渗培养基预培养36h；5％DMSO，15％PEG4000，0.5mol/L蔗糖三种冷冻保护剂组合使用，程序降温至-80℃停留30min后投入液氮罐中保存；32℃水浴解冻，蔗糖溶液清洗后转接至LP培养基上恢复生长。在此程序处理下，冷冻90d的愈伤组织1个月后可恢复再生，再生率最高达100％，再生愈伤组织生长状态良好并依然保持分化成熟体胚的能力。本申请初步建立了抗松针褐斑病湿地松胚性愈伤组织的超低温保存体系，为抗性湿地胚性愈伤组织胚性的长期维持提供了技术参考。附图说明图1是各因素对湿地松愈伤组织细胞活力的影响图；图中，数据采集于解冻后7d，同一因素中不同字母表示差异显著，p＜0.05；图2是解冻后湿地松胚性愈伤组织的恢复生长图；图中，A-P为1-16号处理；图3是解冻后湿地松胚性愈伤组织的增殖与成熟图；图中，A：未冷冻的愈伤组织；B：冷冻10d后恢复生长的愈伤组织；C：冷冻40d后恢复生长的愈伤组织；D：冷冻90d后恢复生长的愈伤组织；E：未冷冻的愈伤组织显微结构；F：冷冻90d后恢复生长愈伤组织的显微结构；G：未冷冻的愈伤组织成熟；H：冷冻90d后恢复生长愈伤组织的成熟。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术做进一步的说明。以下实施例所使用的材料如下：湿地松27#家系未成熟球果采自福建华安西陂国有林场的抗松针褐斑病湿地松种子园。超低温保存材料为2017年6-7月方珞采集未成熟合子胚诱导获得的胚性愈伤组织，编号为27-1，在LP培养基上进行继代培养，每15d继代一次(方珞，2018)。实施例1抗性湿地松胚性愈伤组织的超低温保存1超低温保存预处理继代(第24次)后10-12d，称取0.3g湿地松胚性愈伤组织，置于添加了0.5mol/L蔗糖的高渗培养基上进行预培养，设置不同培养时间(12、24、36、48h)。然后，使用不同浓度的DMSO(2.5、5、10、15％)，不同浓度的PEG4000(0、5、10、15％)和不同浓度的蔗糖(0、0.4、0.5、0.6mol/L)作为冷冻保护剂对愈伤组织进行预处理。具体见表1。2超低温保存将预培养后的胚性愈伤组织置于冷冻管中，将加入冷冻保护剂的冷冻管置于程序降温仪内，设定本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.抗松针褐斑病湿地松胚性愈伤组织的超低温保存方法，其特征在于，包括以下步骤：1)湿地松细胞系的胚性愈伤组织置于含有蔗糖的增殖培养基中预培养；2)预培养后的胚性愈伤组织置于冷冻管中，加入冷冻保护剂，进行程序降温，温度降至‑80℃后取出冷冻管并迅速投入液氮，进行超低温保存；其中，冷冻保护剂的组分和浓度为：DMSO浓度为2.5～15％，蔗糖浓度为0～0.6mol/L，PEG4000浓度为0～15％，蔗糖和PEG4000的组分浓度不同时为0；3)使用时，取超低温保存胚性愈伤组织水浴条件下进行解冻，待冰完全溶化后立即将冷冻管取出。

【技术特征摘要】
1.抗松针褐斑病湿地松胚性愈伤组织的超低温保存方法，其特征在于，包括以下步骤：1)湿地松细胞系的胚性愈伤组织置于含有蔗糖的增殖培养基中预培养；2)预培养后的胚性愈伤组织置于冷冻管中，加入冷冻保护剂，进行程序降温，温度降至-80℃后取出冷冻管并迅速投入液氮，进行超低温保存；其中，冷冻保护剂的组分和浓度为：DMSO浓度为2.5～15％，蔗糖浓度为0～0.6mol/L，PEG4000浓度为0～15％，蔗糖和PEG4000的组分浓度不同时为0；3)使用时，取超低温保存胚性愈伤组织水浴条件下进行解冻，待冰完全溶化后立即将冷冻管取出。2.根据权利要求1所述的抗松针褐斑病湿地松胚性愈伤组织的超低温保存方法，其特征在于，步骤1)中，湿地松细胞系为湿地松27-1系。3.根据权利要求1所述的抗松针褐斑病湿地松胚性愈伤组织的超低温保存方法，其特征在于，步骤1)中，预培养时间为12～48h。4.根据权利要求3所述的抗松针褐斑病湿地松胚性愈伤组织的超低温保存方法，其特征在于，步骤1)中，预培养时间为36h。5.根据权利要求1所述的抗松针褐斑病湿地松胚性愈伤组织的超低温保存方法，其特征在于，步骤2)中，冷冻保护剂的组分和浓度为：DMSO浓度为5％，蔗糖浓度0.5mol/L...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱丽华，杨帆，夏馨蕊，方天雨，叶建仁，
申请(专利权)人：南京林业大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32