一种植物样品中内源性油菜素甾醇的样品前处理方法及其采用的前处理固相材料技术

本发明专利技术公开了一种植物样品中内源性油菜素甾醇的样品前处理方法及其采用的前处理固相材料。该方法先以溶剂提取内源性油菜素甾醇，用吸附有硼亲和试剂的固相材料对所得提取溶液中的油菜素甾醇进行衍生和同步萃取，然后在解吸时同步引入盐诱导相转移萃取，进一步除去过量硼亲和试剂及亲水性杂质，进而实现了植物样品中内源性油菜素甾醇的选择性富集。该方法简单、快速、高灵敏、高通量，尤其在去除植物提取液内源性杂质方面表现出高选择性，可实现低含量的内源性油菜素甾醇的前处理，结合化学衍生，进而提高分析检测植物样品中内源性油菜素甾醇的灵敏度。

A sample pretreatment method for endogenous brassinol in plant samples and its solid phase materials

【技术实现步骤摘要】
一种植物样品中内源性油菜素甾醇的样品前处理方法及其采用的前处理固相材料
本专利技术涉及一种植物样品中内源性油菜素甾醇选择性富集的样品前处理方法及其前处理固相材料，属于分析化学领域。
技术介绍
油菜素甾醇(brassinosteroids,BRs)是一类多羟基化的甾醇类化合物，在植物体内含量极低，但调控着植物的一系列生理学和代谢过程。近年来，关于油菜素甾醇的生理学机能，例如BRs的生物合成，降解以及代谢路径的研究收到广泛关注。但由于植物提取液中基质复杂且油菜素甾醇含量极低，这些研究的开展受到一定限制。因此，建立高效的样品前处理方法并结合灵敏的检测手段是内源性BRs检测的关键。目前，基于液相色谱-质谱联用(LC-MS)的方法因其高灵敏度和高选择性已成为BR分析方法的主流，然而仍存在问题：一是，植物基质复杂，干扰BR的检测。基于此，人们引入了多种前处理方法对BR进行萃取除杂。已报道的植物中油菜素甾醇的前处理方法包括液液萃取、固相萃取(SPE)、固相微萃取、磁固相萃取和固相分散微萃取等。这些方法大都利用材料与BR之间的疏水或亲水相互作用，选择性不佳。随后人们提出的利用硼亲和材料中的硼酸基团与BR顺式羟基间的硼亲和作用实现对BR的萃取。尽管选择性得到较大改善，但材料合成复杂繁琐，BR与材料间的解吸困难，往往需要引入双氧水等氧化剂。例如，CN2013101314228中对BR进行萃取时，需采用提前合成的苯硼酸磁性纳米材料，且需要采用解吸液对BR进行解吸，过程相对繁琐。二是，由于BR的离子化效率不佳，在二级质谱中的诱导碰撞解离(CID)上的碎裂行为不佳，导致其在MS上的信号响应差，灵敏度低。基于此，人们引入化学衍生法，通过信号响应好的硼亲和试剂对BR进行衍生。此步骤往往在萃取之后，即增加了前处理步骤和时间。因为当采用SPE模式对BR进行萃取时，若将衍生萃取同步进行，可能会由于分子间碰撞不充分导致衍生化反应无法充分进行。随后原位衍生技术被提出，此技术能将衍生和萃取步骤同步进行。但依然存在问题：为了保证衍生化反应充分进行，一般会引入相对分析物大大过量的衍生化试剂，而这会对分析物的检测造成干扰。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是对现有的油菜素甾醇前处理方法进行改进，提供一种同时具备高灵敏度、高选择性、高通量且简便快速的植物样品前处理方法，实现内源性油菜素甾醇的样品前处理，进而提高分析检测植物样品中内源性油菜素甾醇的灵敏度。本专利技术为解决上述提出的问题所采用的技术方案为：一种植物样品中内源性油菜素甾醇的样品前处理方法，主要包括以下步骤：1)在植物样品中定量加入多种内源性油菜素甾醇的同位素内标，然后以溶剂提取，得到样品溶液；2)将步骤1)所得样品溶液中加入吸附有硼亲和试剂的固相材料，对样品溶液中的油菜素甾醇进行衍生和同步萃取；其中，所述吸附有硼亲和试剂的固相材料包括硼亲和试剂和固相基体材料两部分，硼亲和试剂与固相基体材料之间依靠强阳离子交换作用与疏水作用结合，硼亲和试剂的结构通式如式1或式2所示：式1、式2中，Z为苯基或苯甲基，Y为仲胺、叔胺基团，A为季铵盐基团，X为卤素离子；3)将步骤2)所得固相材料中加入解吸液和盐，对油菜素甾醇的衍生产物进行解吸和同步盐诱导相转移萃取，然后弃去下层解吸液以除去过量硼亲和试剂及亲水性杂质，收集上层解吸液，从而实现植物样品中多种内源性油菜素甾醇的样品前处理。按上述方案，所述固体基体材料为含有阳离子交换基团的硅胶颗粒、磁性材料、无定型材料、凝胶、填充柱或整体柱等中的一种。按上述方案，所述吸附有硼亲和试剂的固相材料可直接由固体基体材料置于含有硼亲和试剂的溶液中振荡吸附获得。进一步地，固体基体材料与含有硼亲和试剂的溶液的比例在1：1至100：1之间(mg/mL)；含有硼亲和试剂的溶液的浓度在0.5mg/mL至10mg/mL之间。具体地，步骤1)的操作方法为：准确称量植物样品后将其置于研钵中，液氮冷冻研磨至粉末状后，加入[2H3]油菜素内酯、[2H3]油菜素甾酮和[2H3]香蒲甾醇等同位素内标。然后加入溶剂提取，静置，离心取上清液，得到未完全除杂的样品溶液。植物组织提取溶剂的作用是：在有效地提取出分析物的前提下，尽可能少地提取杂质等干扰物。该步骤中提取所用的溶剂主要选自甲醇、乙腈、异丙醇、氯仿、二氯甲烷、乙酸乙酯、正己烷、乙醚、丙酮或甲酸等中的一种或几种。按上述方案，所述步骤1)所得样品溶液体积与加入吸附有硼亲和试剂的固相材料的质量比为1：50至1：5之间(mL/mg)。按上述方案，步骤2)中加入吸附有硼亲和试剂的固相材料时加入部分水，并与步骤1)所得样品溶液混合，构成含水30～50％的溶液，以此解决材料与BR之间由于少量水存在时的亲水作用导致的萃取不稳定问题。按上述方案，步骤3)所述解吸液是包括水、与水互溶的有机溶剂的混合溶液，水、与水互溶的有机溶剂之间体积比大约为9：10至19：20之间。解吸液的作用是：破坏已结合BR的硼亲和试剂与固体基体材料间的疏水作用，将BR衍生产物从固体基体材料上解吸下来。按上述方案，步骤3)中，盐加入的质量与步骤3)所述解吸液总体积的比约为20：1至50：1之间(mg/mL)。其中，所述与水互溶的有机溶剂为丙酮、乙腈，乙醇、甲醇等。所述盐主要选自甲酸铵、乙酸铵、氯化钾、氯化钠、氯化钙、磷酸钙等中的一种或几种。盐的加入，可以破坏已结合BR的硼亲和试剂与固体基体材料间的离子交换作用，将BR衍生产物进一步从固体基体材料上解吸下来。同时，由于盐析效应解吸液将分层。此时BR衍生产物绝大部分溶于上层有机层，而过量硼亲和试剂(>70％)以及盐溶于下层水层，由此实现了衍生后同步解吸以及萃取除杂。按上述方案，步骤3)中收集上层解吸液后，还包括去除上层解吸液中的有机溶剂，然后复溶，获得可以直接用于定量分析检测植物样品中内源性油菜素甾醇的待测溶液。本专利技术在上述前处理方法的基础上还提供一种植物样品中内源性油菜素甾醇的定量分析检测方法，将前处理方法所得植物样品中内源性油菜素甾醇的待测溶液通过分析仪器采集响应信号或者数据，结合稳定同位素稀释和标准曲线法测定植物样品中内源性油菜素甾醇的含量。其中，所述分析仪器可以采用液相色谱-质谱仪联用、毛细管电泳-质谱仪联用等。与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：1、本专利技术采用吸附有硼亲和试剂的固相材料，依靠疏水作用力和离子交换作用力。既能保证硼亲和试剂与固相材料间的紧密结合，又使得硼亲和试剂衍生BR后能轻松从固相材料上解吸下来，解吸简单方便，还能避免复杂硼亲和材料的合成。而采用常规硼亲和材料，需采用氧化剂如H2O2才能将BR从材料上解吸下来。H2O2有可能使BR氧化导致检测不准。2、本专利技术中衍生和萃取是同步完成的。由于硼亲和衍生试剂被吸附在固相基体材料上，以上作为一个整体对BR进行萃取；而解吸时破坏的是硼亲和衍生试剂与固相基体材料上的作用力，因此BR衍生产物即在萃取之时就已生成。3、本专利技术中在解吸时采用同步盐诱导相转移萃取，去除了70％过量的衍生化试剂，加之化学衍生，使得BR灵敏度提高4000倍。4、本专利技术所述前处理方法可直接用于植物样品中内源性油菜素甾醇的定量分析检测，同时具有简单、快速、高灵敏度、高通量的优点。此外，本专利技术所述前处理方法在去本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于植物样品中内源性油菜素甾醇的样品前处理固相材料，其特征在于它为一种吸附有硼亲和试剂的固相材料，包括硼亲和试剂和固相基体材料两部分，硼亲和试剂与固相基体材料之间依靠强阳离子交换作用与疏水作用结合；其中，硼亲和试剂的结构通式如式1或式2所示：

【技术特征摘要】
1.一种用于植物样品中内源性油菜素甾醇的样品前处理固相材料，其特征在于它为一种吸附有硼亲和试剂的固相材料，包括硼亲和试剂和固相基体材料两部分，硼亲和试剂与固相基体材料之间依靠强阳离子交换作用与疏水作用结合；其中，硼亲和试剂的结构通式如式1或式2所示：式1、式2中，Z为苯基或苯甲基，Y为仲胺、叔胺基团，A为季铵盐基团，X为卤素离子。2.根据权利要求1所述的一种用于植物样品中内源性油菜素甾醇的样品前处理固相材料，其特征在于所述固体基体材料为含有阳离子交换基团的硅胶颗粒、磁性材料、无定型材料、凝胶、填充柱或整体柱中的一种。3.根据权利要求1所述的一种用于植物样品中内源性油菜素甾醇的样品前处理固相材料，其特征在于所述吸附有硼亲和试剂的固相材料直接由固体基体材料置于含有硼亲和试剂的溶液中吸附获得。4.根据权利要求3所述的一种用于植物样品中内源性油菜素甾醇的样品前处理固相材料，其特征在于所说固体基体材料质量与含有硼亲和试剂的溶液体积的比例在(1～100)mg：1mL，含有硼亲和试剂的溶液的浓度在0.5～10mg/mL。5.一种植物样品中内源性油菜素甾醇的样品前处理方法，其特征在于主要包括以下步骤：1)在植物样品中定量加入多种内源性油菜素甾醇的同位素内标，然后以溶剂提取，得到样品溶液；2)将步骤1)所得样品溶液中加入吸附有硼亲和试剂的固相材料，对样品溶液中的油菜素甾醇进行萃取和同步标记；其中，所述吸附有硼亲和试剂的固相材料为权利要求1所述的样品前处理固相材料；3)将步骤2)所得固相材料中加入解吸液和盐，对油菜素甾醇的衍生产物进行...

【专利技术属性】
技术研发人员：冯钰锜，罗晓彤，蔡保东，
申请(专利权)人：武汉绿剑可瑞信科技有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北,42