一种高轮环藤宁和千金藤素含量的地不容的组培繁育方法技术

本发明专利技术提供了一种高轮环藤宁和千金藤素含量的地不容的组培繁育方法，本方法包括如下步骤：地不容外植体的选取与消毒处理后，接种到腋芽诱导培养基上，将获得的腋芽切下转入培养基进行带芽愈伤诱导，然后将带芽愈伤转接到不定芽培养基上诱导不定芽的分化，不定芽的数量达10～20个/40天，添加嘧啶醇抑制芽的伸长并诱导生根，炼苗后移栽，成活率达90％以上；本方法适合工业化生产，具有繁殖速度快、扩增系数大、保持原有品种的优良性状等优点。

A Tissue Culture and Propagation Method of Dipterygium wilfordii with High Ring Teng Ning and Senecio wilfordii Content

【技术实现步骤摘要】
一种高轮环藤宁和千金藤素含量的地不容的组培繁育方法
本专利技术涉及一种高轮环藤宁和千金藤素含量的地不容的组培繁育方法，属于植物领域。技术背景地不容(Stephaniaepigaea)是防己科(Menispermaceae)千金藤属(Stephania)山乌龟亚属植物，本属植物具有硕大块根且裸露于地面形似乌龟，因此别名称“山乌龟”，是我国的传统中草药，其块根入药，在长江流域以南各地尤其是华南和西南等地少数民族中使用广泛。地不容富含千金藤素、轮环藤宁等生物碱，前者用于白细胞增生剂千金藤素片的研药，后者是环轮宁(轮环藤宁双溴甲烷盐)的前体。通过在滇西、滇西南和部分广西等地野外地不容资源调查，对不同生态位的30个地不容居群，每个居群分别选雌、雄株各20株，共600余株，选裸露于地面块茎直径在10～20cm的药用部位进行高效液相含量测定，筛选得到雌株和雄株雄中高含千金藤素(cepharanthine)和轮环藤宁(cycleanine)的品系高轮环藤宁和千金藤素含量的地不容在组培中也存在有诸多问题，例如芽增殖系数偏低，生根困难等技术难题。黄宁珍等(2007，广西地不容组培快繁研究)以嫩茎节段为外植体，在MS+BA1.0mg·L-1+NAA0.1mg·L-1培养基上先诱导出芽，再经过3种培养基交替培养，增殖系数也仅为6.0倍/50d。专利技术人在实验研究地不容组培快繁中发现，芽增殖过程中，激素BA浓度在1.0～3.0mg·L-1时，偏向于愈伤组织的形成，对芽的增值效果不佳，把带芽的愈伤组织转接到MS+BA0.4～0.8mg·L-1+NAA0.2mg·L-1上有不定芽的分化，而切除上部芽的愈伤很难分化出不定芽，需要更长时间的诱导且数量极少，原因可能是愈伤上部的芽合成一些微量物质而促进不定芽的分化，而使用文献中提供的生根培养基无法使高轮环藤宁和千金藤素含量的地不容生根，直接造成无法获得能够成活的地不容组织。综上所述，目前高轮环藤宁和千金藤素含量的地不容的组培快速繁殖存在有增殖系数低、诱导不定芽难、生根难等技术问题，阻碍了地不容的快速繁殖。
技术实现思路
针对上述技术问题，专利技术人提供了一种高轮环藤宁和千金藤素含量的地不容的组培繁育方法，其中，所述组织繁育方法包括以下步骤：1)芽诱导，选取高轮环藤宁和千金藤素含量的地不容带节嫩茎段为外植体，经过灭菌操作，接种到芽诱导培养基上培养，所述芽诱导培养基配方为1/2MS+BA0～0.5mg·L-1+IBA0～0.2mg·L-1，诱导新芽；2)愈伤诱导，当新芽长到2～3cm后剪切转接到愈伤诱导培养基上培养，所述愈伤诱导培养基为MS+BA1.0～2.0mg·L-1+NAA0.2mg·L-1，诱导带芽愈伤；3)不定芽分化，将带芽的愈伤接到不定芽诱导分化培养基上培养，所述不定芽分化培养基配方为MS+BA0.4～0.8mg·L-1+NAA0.2mg·L-1，诱导不定芽；4)生根培养，剪切不定芽尖转接到生根培养基上培养，所述生根培养基配方为1/2MS+IBA0.5～1.0mg·L-1+嘧啶醇1.0～2.0mg·L-1，诱导生根；5)炼苗，当步骤4)诱导出根6～9根，长3～5cm后，进行炼苗3～5天；6)移栽，清洗干净根上的培养基，移栽到装有灭菌处理的土壤基质，浇水；7)水、肥及病虫害预防管理，即得所需地不容待大田移栽壮苗。在上述高轮环藤宁和千金藤素含量的地不容组培繁育方法，其中，步骤1)所述地不容外植体选取时间为每年公历3-4月份。本方法中嫩茎段能显著提地不容的组培繁殖系数，外植体选取中以截取嫩茎段优先；在上述高轮环藤宁和千金藤素含量的地不容组培繁育方法，其中，步骤1)所述灭菌操作为流水冲洗30min，使用75％酒精水溶液浸泡20-30s，0.2％HgCl2灭菌6-10min后，无菌水漂洗后，擦干。在上述高轮环藤宁和千金藤素含量的地不容组培繁育方法，其中，步骤1)所述芽诱导培养基配方优选1/2MS+6BA0.5mg·L-1+IBA0.1mg·L-1。该方法中MS为Murashige和Skoog培养基；1/2MS为稀释1倍的MS培养基，BA为6苄基嘌呤，IBA为吲哚丁酸(下同)在上述地不容组培繁育方法，其中，步骤2)所述愈伤诱导培养基MS+BA1.5mg·L-1+NAA0.2mg·L-1。该方法中NAA为萘乙酸(下同)，MS+BA1.5mg·L-1+NAA0.2mg·L-1能显著诱导带芽愈伤组织。在上述高轮环藤宁和千金藤素含量的地不容组培繁育方法，其中，步骤3)所述不定芽分化培养基配方为MS+BA0.5mg·L-1+NAA0.2mg·L-1，所述芽尖0.5～1cm，该芽尖能显著提高生根能力。在上述高轮环藤宁和千金藤素含量的地不容组培繁育方法，其中，步骤4)所述生根培养基配方为1/2MS+IBA0.8mg·L-1+嘧啶醇1.0～2.0mg·L-1。该方法中嘧啶醇是赤霉素抑制剂，能抑制芽增长的同时，促进根的再生，是地不容生根的决定因素之一。所述MS、IBA、BA、NAA和嘧啶醇均为固体，配置溶剂为水。其中嘧啶醇为高轮环藤宁和千金藤素含量的地不容组培生根所必须的，1.0～2.0mg·L-1的浓度范围是专利技术人通过实验摸索得到的，高于或低于这个浓度，这类地不容组胚芽将无法生根，或产生代愈伤的根，导致无法移栽成活。在上述高轮环藤宁和千金藤素含量的地不容组培繁育方法，其中，步骤6)所述土壤基质为腐殖土：细河沙质量比1:1，所述灭菌处理为500倍水稀稀释多菌灵，500水稀释倍敌白虫，分别进行表面喷湿灭菌。在上述高轮环藤宁和千金藤素含量的地不容组培繁育方法，其中，所述芽诱导培养基、愈伤诱导培养基、不定芽分化培养基和生根培养基均为灭菌后培养基，灭菌方法为121℃高压灭菌20min，灭菌前pH调至5.5-6.0。优选5.8。在上述高轮环藤宁和千金藤素含量的地不容组培繁育方法，其中，步骤1)-5)的培养温度为25±2℃，光照强度为1600～1800lx，该温度和光照条件能显著增加组培地不容的生长。将营养袋放入盛水的水槽中，使水反向渗透直至浸润整袋基质后，取出营养袋控水，至没有水分渗出为止，是营养袋浇透水。在上述高轮环藤宁和千金藤素含量的地不容组培繁育方法，其中，步骤7)所述肥水及病虫害预防方法为甲霜灵锰锌喷施和多菌灵交替处理防治根部真菌病害，以2.5％氯氰菊酯喷施预防虫害，以纯氮2kg/667m2，用磷酸二氢钾和氯化钾补齐磷、钾(N:P:K3:1:3)，10天左右，按低于0.5％进行1次喷施。在上述高轮环藤宁和千金藤素含量的地不容组培繁育方法，其中，所述的外植体灭菌、继代等过程均在无菌环境中操作。在上述高轮环藤宁和千金藤素含量的地不容组培繁育方法，其中，所述的芽诱导、愈伤诱导、不定芽分化、生根培养基，均加琼脂5.6g·L-1，蔗糖20～30g·L-1。所述高轮环藤宁和千金藤素含量的地不容外植体的获得方式：地不容野外雌、雄植株采收，称取药用部分，干燥；轮环藤宁和千金藤素测量的HPLC样品准备中，取干燥药材，用95％乙醇(1g料：5ml液)事先浸泡再连续回流提取；乙醇提取液减压回收得到浸膏，所述浸膏用2％(质量百分数)的稀硫酸酸化溶解，并调pH(3-4)，用氯仿萃取2次后，回收溶剂部分；酸水溶液用浓氨水碱化，并调pH本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种高轮环藤宁和千金藤素含量的地不容的组培繁育方法，其特征在于，所述组织繁育方法包括以下步骤：1)芽诱导，选取高轮环藤宁和千金藤素含量的地不容带节嫩茎段为外植体，经过灭菌操作，接种到芽诱导培养基上培养，所述芽诱导培养基配方为1/2MS+BA 0～0.5mg·L

【技术特征摘要】
1.一种高轮环藤宁和千金藤素含量的地不容的组培繁育方法，其特征在于，所述组织繁育方法包括以下步骤：1)芽诱导，选取高轮环藤宁和千金藤素含量的地不容带节嫩茎段为外植体，经过灭菌操作，接种到芽诱导培养基上培养，所述芽诱导培养基配方为1/2MS+BA0～0.5mg·L-1+IBA0～0.2mg·L-1，诱导新芽；2)愈伤诱导，当新芽长到2～3cm后剪切转接到愈伤诱导培养基上培养，所述愈伤诱导培养基为MS+BA1.0～2.0mg·L-1+NAA0.2mg·L-1，诱导带芽愈伤；3)不定芽分化，将带芽的愈伤接到不定芽诱导分化培养基上培养，所述不定芽分化培养基配方为MS+BA0.4～0.8mg·L-1+NAA0.2mg·L-1，诱导不定芽；4)生根培养，剪切不定芽尖转接到生根培养基上培养，所述生根培养基配方为1/2MS+IBA0.5～1.0mg·L-1+嘧啶醇1.0～2.0mg·L-1，诱导生根；5)炼苗，当步骤4)诱导出根6～9根，长3～5cm后，进行炼苗3～5天；6)移栽，清洗干净根上的培养基，移栽到装有灭菌处理的土壤基质，浇水；7)水、肥及病虫害预防管理，即得所需地不容大田移栽壮苗。2.根据权利要求1所述地不容组培繁育方法，其特征在于，步骤1)所述地不容外植体选取时间为每年公历3-4月份，截取嫩茎段用于外植体。3.根据权利要求1所述地不容组培繁育方法，其特征在于，步骤1)所述灭菌操作为流水冲洗30min，使...

【专利技术属性】
技术研发人员：林艳和，杜江，李村富，林春，刘正杰，毛自朝，
申请(专利权)人：云南生物谷药业股份有限公司，
类型：发明
国别省市：云南,53