一种鸭源鹅细小病毒的病毒样颗粒及其制备方法技术

本发明专利技术提供一种鸭源鹅细小病毒的病毒样颗粒，其中制备病毒样颗粒所使用的重组杆状病毒中包含有编码VP2蛋白的核苷酸片段；所述的VP2蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:3；编码基因的核苷酸片段，其序列为SEQ ID NO:4。本发明专利技术所制备的病毒样颗粒用于制备疫苗。本发明专利技术制备的疫苗免疫番鸭后能提高番鸭的抗体水平，保证其子代母源抗体水平，预防番鸭源小鹅瘟病毒引起的雏番鸭小鹅瘟病毒感染。

【技术实现步骤摘要】
一种鸭源鹅细小病毒的病毒样颗粒及其制备方法
本专利技术属于家禽疫苗
，具体涉及一种鸭源鹅细小病毒的病毒样颗粒及其制备方法。
技术介绍
鹅细小病毒病又称Derzsy氏病，俗称鹅流感、鹅或小鹅瘟、鹅肝炎、鹅肠炎等，是一种侵害幼鹅和番鸭的一种高度接触传染性疾病。根据感染雏鹅、雏鸭的日龄不同，该病可表现为急性、亚急性和慢性型。急性型可引起10日龄以内的雏鹅100％死亡。许多国家也报道了一种抗原性完全不同的番鸭细小病毒感染，死亡率高达80％。该病主要发生于1～3周龄的雏鹅和雏番鸭，尤其是1周龄左右的更易感，4周龄以上的鹅或番鸭感染后，很少表现临床症状。本病最早于20世纪60年代中后期出现于中国和许多欧洲国家，直到1978年才将该病称为鹅细小病毒感染，但是通过病毒中和试验、分子生物学研究证明，从鹅和番鸭分离到的细小病毒有明显的差异。2015年以来，我国福建等地方的半番鸭和樱桃谷鸭流行一种以软脚、短嘴和生长障碍为主要特征的新发疫病(暂名“短嘴矮小综合症”，养殖户称之为“短嘴病”、“玻璃鸭”、“长舌鸭”等等)，从病料中分离到这种新型病毒，命名为番鸭源小鹅瘟病毒(MuscovyDuckderivedgooseparvovirus，MDGPV)。因此，就需要研制一种有效的疫苗来预防番鸭源小鹅瘟病毒。MDGPV为细小病毒科细小病毒属成员，为单股、线性DNA病毒。基因组大小约为5kb，编码区含有2个开放阅读框，其中右侧ORF编码3种结构蛋白，即VP1、VP2、VP3；三者共用同一终止密码子，起始密码子各不相同，其分子质量由大到小排列依次为VP1、VP2、VP3。其中VP2结构蛋白是病毒刺激机体产生保护性抗体的重要抗原蛋白。杆状病毒是一类大型的杆状囊膜病毒，基因组为环状双链DNA，大小约为80-180kbp。杆状病毒作为病原微生物寄生于节肢动物，具有高度的宿主特异性，其宿主主要有鳞翅目双翅目和膜翅目昆虫，尚未发现节肢动物以外的杆状病毒宿主。在杆状病毒的众多成员中，目前研究和利用最多的是苜蓿银纹夜蛾多粒包埋核型多角体病毒(AcMNPV)。AcMNPV病毒基因组为共价闭合环状超螺旋的双链DNA，约130kb,其基因组序列目前已测出。近年来，杆状病毒表达载体以自身的优势，已经在表达载体上占了主导的地位。杆状病毒表达系统与其他的表达系统相比，杆状病毒表达系统具有操作简单、安全性高，可容纳大的目的基因，表达外源蛋白效力高，有翻译后修饰的作用，表达蛋白的免疫原性、生物活性与天然的蛋白相似等优点(Andersonetal.,1995；Wangetal.,2001；Ribeiroetal.,2001)。
技术实现思路
本专利技术提供一种鸭源鹅细小病毒的病毒样颗粒及其制备方法，从而弥补现有技术的不足。本专利技术首先提供一种重组杆状病毒，其中包含有编码VP2蛋白的核苷酸片段；所述的VP2蛋白，其氨基酸序列为SEQIDNO:3；所述的核苷酸片段，其序列为SEQIDNO:4；本专利技术所构建的重组杆状病毒用于在昆虫细胞中制备鸭源鹅细小病毒的病毒样颗粒；本专利技术再一个方面提供一种鸭源鹅细小病毒的病毒样颗粒，是使用上述的重组杆状病毒感染昆虫细胞后，培养收集获得的。所述的昆虫细胞为昆虫细胞Sf9；本专利技术所制备的病毒样颗粒用于制备疫苗；本专利技术还提供一种番鸭源小鹅瘟病毒亚单位疫苗，包括有抗原和疫苗佐剂，其所用的抗原为本专利技术制备的病毒样颗粒；本专利技术制备的疫苗免疫番鸭后能提高番鸭的抗体水平，保证其子代母源抗体水平，预防番鸭源小鹅瘟病毒引起的雏番鸭小鹅瘟病毒感染。具体实施方式本专利技术通过对番鸭源小鹅瘟病毒的cDNA全序列进行筛选和分析，选取了其中一段抗原表位较丰富、能够在昆虫细胞中高效表达的VP2的cDNA序列。对VP2蛋白进行改造后，利用昆虫细胞-杆状病毒表达系统制备的VLP，病毒蛋白产量显著高于鸭胚培养的病毒，生产成本明显降低。下面结合具体实施例对本专利技术进行详细的描述。本专利技术所应用的方法可以采用疫苗制备领域中常用的方法，而不仅限于本专利技术实施例的具体记载，本领域的普通技术人员可以其它常规方法来实现本专利技术。实施例1、番鸭细小病毒VP2蛋白的筛选2015年某鸭场的雏番鸭群中出现了典型的番鸭细小病毒病症状。为了分离病原，无菌采集濒死鸭的肝脏、脾脏及胰腺，用无菌生理盐水匀浆制成悬液，离心取上清除菌后经尿囊腔分别接种11日龄番鸭胚，孵化168小时，收集24小时后死亡胚的尿囊液及胚体组织，经匀浆后，反复冻融后，取上清液冻存。收获的病毒液经纯化后进行了病毒含量、免疫原性、特异性及纯净性等方面的病毒特性的分析检测，结果表明分离的毒株与番鸭细小病毒发生特异性反应，无细菌、支原体及外源病毒污染；纯化后的病毒株命名为YBMDGPV2015。对于本专利技术筛选的毒株的性状进行检测，结果表明，该株病毒属细小病毒，攻毒实验结果表明筛选的该病毒可引起雏番鸭发生以腹泻、部分鸭肠粘膜脱落形成栓塞为特征的番鸭细小病毒病。该毒株制备的疫苗免疫1日龄雏番鸭，10天就可产生抗体，免疫期可达6个月以上；免疫成年番鸭后，能保护免疫6个月内种番鸭所产子代免受流行毒株的攻击。对筛选鉴定的YBMDGPV2015株的结构蛋白基因VP2进行了测序，VP2基因全长1770bp，编码589个氨基酸，其氨基酸序列为SEQIDNO:1，编码基因的核苷酸序列为SEQIDNO:2；将其与GenBank中收录的VP2基因序列进行遗传进化树及核苷酸序列同源性分析，发现本专利技术获得YBMDGPV2015株的VP2基因与另外30个GPV毒株的VP基因同源性介于92.7％～98.3％之间。结果表明筛选病毒的VP2蛋白与已报道的小鹅瘟病毒VP2基因存在着氨基酸差异。实施例2、表达VP2基因的重组杆状病毒的构建2.1VP2基因的剪切、优化将vp2基因的parvo_coat结构域进行剪切，将N端70aa剪切掉，把C端31aa剪切掉，同时将第336位V突变为P，从而帮助蛋白更好地折叠为三级结构，将其抗原位点更好地暴露出来。优化修饰后的氨基酸的序列为SEQIDNO:3，能很好地表达出抗原位点，且能自动组装成VLPS。将选取的基因进行了密码子优化，优化后的基因的核苷酸序列为SEQIDNO:4。2.2酶切反应2.2.1标记好需要用到的1.5mLEP管，在1.5mLEP管中按照下表进行加样、混匀：反应体系为50μL，加样如下表所示：2.2.2将步骤2.2.1中的1.5mLEP管置于37℃恒温水浴锅中，水浴2-3h。2.2.3双酶切产物胶回收取出上述双酶切体系，进行琼脂糖凝胶电泳以回收其中的DNA片段。(1)标记好样品收集EP管、吸附柱以及收集管。(2)称取标记好的空的EP管重量，并记录数值。(3)将单一的目的DNA条带在切胶仪上从琼脂糖凝胶中用手术刀小心切下放入干净的1.5mL离心管中。(4)向步骤(3)中的1.5mL离心管中加入600μLPCbuffer50℃水浴放置5min左右，其间不断温和上下翻转离心管，以确保胶块充分溶解。(5)柱平衡：向吸附柱CB2中(吸附柱预先放入收集管中)加入500μL平衡液BL，离心12,000rpm，1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。(6)将步骤(5)所得溶液加至吸附柱CB2中，静置2min，10,000rpm本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种重组杆状病毒，其特征在于，所述的重组杆状病毒中包含有编码VP2蛋白的核苷酸片段；所述的VP2蛋白，其氨基酸序列为SEQ ID NO:3。

【技术特征摘要】
1.一种重组杆状病毒，其特征在于，所述的重组杆状病毒中包含有编码VP2蛋白的核苷酸片段；所述的VP2蛋白，其氨基酸序列为SEQIDNO:3。2.如权利要求1所述的重组杆状病毒，其特征在于，所述的核苷酸片段，其序列为SEQIDNO:4。3.权利要求1所述的重组杆状病毒在昆虫细胞中制备鸭源鹅细小病毒的病毒样颗粒的应用。4.一种鸭源鹅细小病...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭伟伟，向银辉，陈俭梅，王丽萍，邹敏，范根成，杜元钊，
申请(专利权)人：青岛易邦生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：山东,37