一种伯氨喹类药物的比色检测方法技术

本发明专利技术涉及一种伯氨喹类药物的比色检测方法，在酸性环境以及亚硝酸盐存在的条件下，对位含有取代基的苯胺可以与伯氨喹发生Griess反应，形成有色偶氮产物；确定上述有色产物的UV‑Vis吸收光谱以及最大吸光值；通过酶标仪检测不同浓度伯氨喹存在下，上述有色偶氮产物的形成及其吸光值的变化；建立伯氨喹浓度与偶氮产物吸光值的标准曲线；通过标准曲线上伯氨喹的浓度与偶氮产物吸收光值的对应关系，确定待测样品中伯氨喹类药物的浓度。该方法已成功用于定量分析合成尿液中伯氨喹的浓度，检出限低至0.63μM。该方法还能在临床相关的浓度范围内从血清样品中检测伯氨喹。

【技术实现步骤摘要】
一种伯氨喹类药物的比色检测方法
本专利技术涉及医药领域，特别涉及一种伯氨喹类药物的比色检测方法。
技术介绍
伯氨喹(PMQ)属8-氨基喹啉类结构，是唯一获得许可用于防治间日疟原虫和卵形疟原虫的抗疟疾药物，也是唯一能够在配子体期有效杀灭疟原虫的强效药物。但是，PMQ的副作用在于常导致葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)缺乏症患者的急性溶血性贫血，溶血的严重程度取决于G6PD缺乏程度、PMQ用药剂量和持续时间。G6PD基因突变的频率在疟疾流行地区为3-30％，分布较广，因此限制了PMQ的广泛使用。虽然世界卫生组织建议使用单一低剂量(0.25mg/kg)来阻止疟疾传播，同时降低溶血风险，但由于地区、性别和年龄的差异，疟疾的治疗仍然面临G6PD患者对药物敏感性多变的问题。人们迫切需要检测生物体液(包括尿液和血液)中的PMQ，对其药代动力学进行评估，进而调整用药剂量。迄今为止，临床检测PMQ的主要方法都是基于高效液相色谱(HPLC)。尽管HPLC的方法在药物测定中具有较高的灵敏度，但它们也具有不可避免的缺点。例如，HPLC通常不能直接测量生物体液中的药物浓度。通过HPLC确定尿液和血清中的药物浓度，需要通过额外的液相或固相萃取法来去除蛋白质、脂质和其他内源性分子。PMQ在260nm波长下具有最大吸收，HPLC方法中PMQ的UV检测通常也在该波长下进行。然而，许多内源性生物分子如氨基酸、维生素、核酸和尿色素等在260nm附近具有强吸收，会干扰PMQ的测定。因此，低成本且易操作、具有高灵敏度和选择性的PMQ检测方法仍然是迫切需要的。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种伯氨喹类药物的比色检测方法。为实现上述目的，本专利技术采取的技术方案为：专利技术人研究发现带有取代基的苯胺在酸性条件下形成重氮盐，随后与伯氨喹偶联形成偶氮产物。通过伯氨喹的Griess反应，开发了一种伯氨喹比色检测法，该方法对伯氨喹测定表现出优异的灵敏度和选择性。其具体方案如下：一种伯氨喹类药物的比色检测方法，包含以下的反应式(I)：其中1为伯氨喹，2为具有取代基的苯胺，3为有色偶氮产物。优选地，所述苯胺为二甲氧基联苯胺。优选地，所述苯胺为3，3’-二甲氧基联苯胺。优选地，所述苯胺取代基为磺酰基、甲基、甲氧基、硝基、羧基、三氟甲氧基、二甲氧基、三甲氧基。优选地，所述苯胺取代基为4-磺酰基、4-甲基、4-甲氧基、4-硝基、4-羧基、4-三氟甲氧基、2，4-二甲氧基、3，4-二甲氧基、3，4，5-三甲氧基。优选地，所述有色偶氮产物为磺酰胺偶氮产物，其最强吸收值在470nm；所述有色偶氮产物为硝基苯胺偶氮产物，其最强吸收值在481nm；所述有色偶氮产物为甲基苯胺偶氮产物，其最强吸收值在492nm；所述有色偶氮产物为对甲氧基苯胺偶氮产物，其最强吸收值在504nm；所述有色偶氮产物为羧酸苯胺偶氮产物，其最强吸收值在477nm；所述有色偶氮产物为三氟甲氧基苯胺偶氮产物，其最强吸收值在475nm；所述有色偶氮产物为2，4-二甲氧基苯胺偶氮产物，其最强吸收值为518nm；所述有色偶氮产物为3，4-二甲氧基苯胺偶氮产物，其最强吸收值为512nm；所述有色偶氮产物为3，4，5-三甲氧基苯胺偶氮产物，其最强吸收值为495nm；所述有色偶氮产物为3，3’-二甲氧基联苯胺与伯氨喹摩尔比1:1反应产物，其最强吸收值在516nm；所述有色偶氮产物为3，3’-二甲氧基连苯胺与伯氨喹摩尔比1:2反应产物，其最强吸收值在584nm。优选地，所述的伯氨喹类药物的比色检测方法，包括以下步骤：(1)将含有取代基的苯胺与伯氨喹在酸性条件下溶解，再加入亚硝酸钠，形成有色偶氮产物；(2)确定上述有色产物UV-Vis吸收光谱以及最大吸光值；(3)通过酶标仪获取苯胺与不同浓度的伯氨喹反应形成的有色偶氮产物的最大吸光值；(4)建立伯氨喹不同浓度与有色偶氮产物吸光值的标准曲线；(5)通过标准曲线上伯氨喹的浓度与吸收光值的对应关系，确定待测样品中伯氨喹类药物的浓度。优选地，所述步骤(1)的反应时间12-15min。优选地，所述步骤(1)在酸性条件下进行，采用5％的磷酸溶液或者0.2M稀盐酸溶液。本专利技术还提供一种伯氨喹类药物的比色检测试剂，包含反应液R1和反应液R2，所述反应液1为稀盐酸溶解的4-甲氧基苯胺溶液；所述反应液2为亚硝酸钠水溶液。本专利技术的有益效果在于：系统的研究了各种取代苯胺与抗疟药伯氨喹发生的Griess反应。具有给电子取代基的苯胺会导致偶氮产物的吸收波长发生红移，使产物呈现更深的颜色。基于4-甲氧基苯胺、伯氨喹和亚硝酸盐之间的Griess反应，开发了用于伯氨喹测定的比色法。该方法已成功用于定量分析合成尿液中伯氨喹的浓度，检出限低至0.63μM。该方法还能在临床相关的浓度范围内从血清样品中检测伯氨喹。附图说明图1为伯氨喹和苯胺通过Griess反应形成有色偶氮产物的示意图；图2为伯氨喹和具有不同取代基的苯胺形成的不同颜色的偶氮产物(A图显示5％磷酸溶液中50μM伯胺的有色偶氮产物；B为标准化后的偶氮产物的UV-Vis光谱，[0-1]标准化。)；图3为4-SO2NH2、4-Me、4-OMe分别与伯氨喹形成的偶氮产物的最大吸收峰值随时间的变化(A图中反应1，2，3分别使用含带取代基的苯胺进行，R＝4-SO2NH2，4-Me，4-OMe，4为伯氨喹对照；B为反应过程中，最大吸收波长下的吸光值随时间的变化情况)；图4为4-甲氧基苯胺与伯氨喹之间的Griess反应用于纯水中伯氨喹检测的标准曲线；图5为4-甲氧基苯胺的Griess反应选择性的响应伯氨喹而不响应其它常见抗疟药示意图；图6为对伯氨喹进行显色检测的操作过程示意图；图7为4-甲氧基苯胺的Griess反应用于尿液中伯氨喹检测的标准曲线；图8为4-甲氧基苯胺的Griess反应直接用于血清中伯氨喹检测的标准曲线；图9为4-甲氧基苯胺的Griess反应测定血清中的伯氨喹浓度(A为从血清样品中提取伯氨喹用于定量分析的示意图；B为纯水中吸光值I504和伯氨喹浓度之间的线性关系(0到100μM的范围内)；C为血清中的伯氨喹通过Griess反应方法的实测值与实际加入血清中的精确量进行比较)。具体实施方式本专利技术人经实验室研究发现：抗疟药伯氨喹可以发生类似Griess反应，反应包括三个步骤：亚硝化、重氮离子形成和偶联。重氮离子由含取代基的苯胺的亚硝化反应形成，在酸性条件下进行内部重排，然后与偶联剂伯氨喹反应形成可供比色分析的有色偶氮产物。实施例1伯氨喹的Griess反应将苯胺和1倍当量的伯氨喹(PMQ)溶解在5％磷酸中，然后在室温(25℃)下缓慢加入亚硝酸钠。通过肉眼观察或者TLC跟踪有色偶氮产物的形成可以方便的监测反应(如图1)。利用在苯环对位具有各种取代基的苯胺进行反应。改变取代基团可以形成不同颜色的产物。如图2所示，具有给电子效应的取代基本上都可引起UV-Vis吸收光谱的红移。强供电性的甲氧基取代的对甲氧基苯胺反应产物3d的光谱在504nm处具有最强的吸收，而强吸电子磺酰胺的产物3a的光谱在470nm处具有最强的吸收。甲基的供电性低于甲氧基，但仍然比磺酰胺、硝基和羧基强很多，较之3d，3c的吸收光谱表现出明显的蓝移，最大峰在492nm处。本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种伯氨喹类药物的比色检测方法，其特征在于，包含以下的反应式(I)：

【技术特征摘要】
1.一种伯氨喹类药物的比色检测方法，其特征在于，包含以下的反应式(I)：其中1为伯氨喹，2为具有取代基的苯胺，3为有色偶氮产物。2.如权利要求1所述的伯氨喹类药物的比色检测方法，其特征在于，所述苯胺为二甲氧基联苯胺。3.如权利要求2所述的伯氨喹类药物的比色检测方法，其特征在于，所述苯胺为3，3’-二甲氧基联苯胺。4.如权利要求1所述的伯氨喹类药物的比色检测方法，其特征在于，所述苯胺取代基为磺酰基、甲基、甲氧基、硝基、羧基、三氟甲氧基、二甲氧基、三甲氧基。5.如权利要求1或4所述的伯氨喹类药物的比色检测方法，其特征在于，所述苯胺取代基为4-磺酰基、4-甲基、4-甲氧基、4-硝基、4-羧基、4-三氟甲氧基、2，4-二甲氧基、3，4-二甲氧基、3，4，5-三甲氧基。6.如权利要求1所述的伯氨喹类药物的比色检测方法，其特征在于，所述有色偶氮产物为磺酰胺偶氮产物，其最强吸收值在470nm；所述有色偶氮产物为硝基苯胺偶氮产物，其最强吸收值在481nm；所述有色偶氮产物为甲基苯胺偶氮产物，其最强吸收值在492nm；所述有色偶氮产物为对甲氧基苯胺偶氮产物，其最强吸收值在504nm；所述有色偶氮产物为羧酸苯胺偶氮产物，其最强吸收值在477nm；所述有色偶氮产物为三氟甲氧基苯胺偶氮产物，其最强吸收值在475nm；所述有色偶氮产物为2，4-二甲氧基苯胺偶氮产物，其最强吸收值为518nm...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘芳，邓涛，伍盛鋆，吴亚兰，
申请(专利权)人：广州中医药大学广州中医药研究院，
类型：发明
国别省市：广东,44