一种延缓体外培养卵子老化的方法技术

本发明专利技术提供一种延缓体外培养卵子老化的方法，属于动物繁殖技术领域。本发明专利技术发现将卵子置于培养液中体外培养过程中添加虾青素(Astaxanthin)可以有效的改善老化卵子的早期胚胎发育、增加老化卵子膜电位、降低老化卵子凋亡率。本发明专利技术所提供的在体外培养卵子的过程中添加虾青素的方法显著延缓了体外培养卵子老化的速度，提高了老化卵子早期胚胎发育率，比常规培养液培养下老化卵子的发育率提高了15％，能够为体外受精‑胚胎移植(IVF‑ET)技术提供高质量的卵子和早期胚胎。

A Method of Delaying Aging of Cultured Oocytes in Vitro

The invention provides a method for delaying aging of cultured eggs in vitro, belonging to the field of animal reproduction technology. The invention discovers that the addition of astaxanthin during the in vitro culture of the eggs in the culture medium can effectively improve the early embryonic development of the aged eggs, increase the membrane potential of the aged eggs, and reduce the apoptotic rate of the aged eggs. The method of adding astaxanthin in the process of culturing eggs in vitro significantly delays the aging rate of cultured eggs in vitro, improves the early embryonic development rate of aged eggs, increases the development rate of aged eggs by 15% compared with that of conventional culture medium, and can provide high quality eggs and early embryos for in vitro fertilization and embryo transfer (IVF ET) technology.

【技术实现步骤摘要】
一种延缓体外培养卵子老化的方法
本专利技术涉及一种延缓体外培养卵子老化的方法，属于动物繁殖

技术介绍
哺乳动物的繁殖能力受多种因素的影响，动物个体本身的衰老和生殖细胞的老化严重影响动物的繁殖效率，而其中卵子的老化严重降低了雌性动物的繁殖能力。卵子的老化与很多因素有关，年龄、卵丘细胞、活性氧的增加、线粒体功能障碍等都可以导致卵子的老化。其中氧化应激导致活性氧的增加是一个很重要的因素。当卵子发生老化后，此时细胞内的氧化及抗氧化平衡便趋向于氧化状态，从而激发蛋白质及脂质等主要成分。同样当细胞内因为各种原因诱发氧化应激状态时又会加速细胞的老化。卵子老化会带来诸多临床不良影响，包括体内受精率降低、胚胎质量低下、早期妊娠流产可能性增加和后代发育异常。采用辅助繁殖技术的卵子在受精前不可避免的需要在体外培养较长一段时间，这就会诱导卵子内发生氧化应激，导致卵子老化。在对受精不成功的卵子使用外在ICSI技术(卵包浆内单精注射技术)时，卵子体外培养时间增加的情况就会发生。因此，若能在体外延缓卵子老化，对于需要延长体外培养卵子时间的辅助生殖技术是极其有应用意义的。虾青素(Astaxanthin,AX)是一种提取自微生物、藻类及海洋甲壳类动物的化合物，属酮式类胡萝卜素，为叶黄素家族中的一员。虾青素特殊的理化性质赋予了它抗氧化、抗癌、抗疲劳、抗衰老、抗炎以及增强免疫力等功能。目前已有研究表明虾青素可以延缓脑衰老和皮肤衰老。然而，国际上目前还没有虾青素改善卵子老化作用机理的研究。如果虾青素在卵子老化模型中发挥作用，这一研究将不仅使人们加深对与卵子老化相关生殖力下降分子机理的认识，还能对卵子老化所导致的生殖问题及后代发育提供新的预防与治疗措施。
技术实现思路
本专利技术目的是提供一种延缓体外培养卵子老化的方法。本专利技术首先提高一种体外培养卵子的培养液，该培养液为本领域公知的用于体外培养卵子的培养液作为母液，在该培养液母液中加入虾青素得到本专利技术提供的上述培养液。优选地，虾青素在上述培养液中的终浓度为1.0-3.0μg/mL；更优选地，虾青素在培养液中的终浓度为2.0μg/mL。所述培养液母液为CZB培养液、CZB、KSOM、HTF、M16、M2、TYH、M199、蔗糖溶液、MEMalpha。进一步地，本专利技术提供一种延缓体外培养卵子老化的方法，采用上述含虾青素的培养液于体外培养卵子。优选地，体外培养卵子的条件为：培养液pH值7.2-7.4、二氧化碳浓度2％-5％、湿度70％-100％、温度30-39℃的条件下体外培养6-24h。更优选地，体外培养卵子的条件为：二氧化碳浓度5％、湿度100％、温度37℃的条件下体外培养12h。本专利技术上述方法适用的卵子为哺乳动物MII期卵子卵丘-卵母细胞复合体(COCs)。所述哺乳动物为牛、羊、猪、鼠。本专利技术提供了虾青素或上述含虾青素的培养液在延缓体外培养卵子的老化、或提高体外培养后卵子的受精率中的应用。本专利技术还提供了虾青素或上述含虾青素的培养液在改善老化卵子的早期胚胎发育中的应用，所述早期胚胎为受精卵期至囊胚期阶段的早期胚胎。进一步地，上述改善老化卵子的早期胚胎发育中的应用是将含虾青素的培养液培养后的老化卵子受精后，将受精卵在pH值7.2-7.4、二氧化碳浓度5％、湿度100％、温度37℃的条件下培养，到4-cell时换到加有葡萄糖的培养液中培养直到囊胚期。本专利技术所述的MII期是指卵子静止于第二次减数分裂中期，也是卵子成熟时期。所述的受精卵是指成熟的卵子与精子结合形成合子。所述囊胚期是指受精卵经过4-5天的发育，形成内细胞团、滋养层细胞和囊胚腔的胚胎发育时期。上述应用的具体应用方式为：在卵子的体外培养过程中，虾青素在卵子培养液中的工作浓度为1.0-3.0μg/mL。优选地，虾青素在卵子培养液中的工作浓度为2.0μg/mL。并且，体外培养卵子的条件为：培养液pH值7.2-7.4、二氧化碳浓度2％-5％、湿度70％-100％、温度30-39℃的条件下体外培养6-24h。优选条件为：培养液pH值7.2-7.4、二氧化碳浓度5％、湿度100％、温度37℃的条件下体外培养12h。本专利技术的优点在于：1、本专利技术方法能够显著提高体外培养12h过程中卵子老化的线粒体膜电位。卵子在体外培养12h的平均线粒体膜电位为0.71，而12h+2.0μg/mLAstaxanthin的平均线粒体膜电位则为1.41，恢复到了接近对照组0h的平均线粒体膜电位1.47。说明虾青素的添加能够改善由体外培养卵子老化导致的线粒体膜电位下降的情况。同时本专利技术方法也可以显著降低体外培养12h过程中卵子老化的早期凋亡率。卵子在体外培养12h的平均早期凋亡率为50％，而12h+2.0μg/mLAstaxanthin的平均早期凋亡率则为13.33％，恢复到了接近对照组0h的平均早期凋亡率5.26％。说明虾青素的添加确实可以改善由体外培养卵子老化导致的早期凋亡率增加的情况。2、提高受精率的囊胚率：本专利技术将小鼠成熟卵子放入正常培养液中进行体外培养12h后受精观察囊胚率为10％-15％，而将小鼠成熟卵子置于添加2.0μg/mL虾青素的培养液中进行体外培养，培养12h后受精观察囊胚率为25％-30％；比常规培养液体外培养卵子的囊胚率提高了15％。3、本专利技术所提供的技术方法操作简便，只需要在体外培养过程中添加一定浓度的虾青素，同时可应用于小型实验动物的体外受精、细胞核移植、单精子注射等胚胎体外生产技术，也可用于人的辅助生殖。总之本专利技术显著延缓了体外培养卵子老化的速度，同时保证了卵子的体外发育能力，从而为延缓或逆转卵子老化提供新的途径，为改进辅助生殖技术提供了参考。附图说明图1为线粒体膜电位荧光图。其中纵坐标分别为高膜电位图(HighΔΨm)、低膜电位图(LowΔΨm)和总膜电位合并图(Merge)。图2为线粒体膜电位数据统计图。纵坐标显示红/绿的荧光强度比值。从图中可以看出12h的线粒体膜电位荧光强度比值显著低于0h和12h+2.0μg/mLAstaxanthin。0h的荧光强度比值与12h相比显著升高，有明显的统计学差异(P＜0.05)，12h的荧光强度比值与12h+2.0μg/mLAstaxanthin相比显著降低，也有明显的统计学差异(P＜0.05)，而0h的荧光强度比值与12h+2.0μg/mLAstaxanthin相比无统计学差异(P＞0.05)。其中横坐标下面括号里的数字表示每组检测的卵子数。图3为早期凋亡荧光图。其中纵坐标分别为凋亡指示剂图(Annexiv-V)、明场图(BF)和合并图(Merge)。图4为早期凋亡数据统计图。纵坐标显示MII期卵子的早期凋亡比率。Annexiv-V指示剂会在发生早期凋亡的卵子周围形成一圈明显的绿色荧光，因此从图中可以看出12h的早期凋亡比例显著高于0h和12h+2.0μg/mLAstaxanthin。0h的早期凋亡比率与12h相比显著降低，有明显的统计学差异(P＜0.05)，12h的早期凋亡比率与12h+2.0μg/mLAstaxanthin相比显著升高，也有明显的统计学差异(P＜0.05)，而0h的早期凋亡比率与12h+2.0μg/mLAstaxanthin相比无统计学差异(P＞0.05)。其中横坐标下面括号本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种体外培养卵子的培养液，其特征在于，其为含有虾青素的培养液。

【技术特征摘要】
1.一种体外培养卵子的培养液，其特征在于，其为含有虾青素的培养液。2.如权利要求1所述的培养液，其特征在于，虾青素在培养液中的终浓度为1.0-3.0μg/mL优选虾青素在培养液中的终浓度为2.0μg/mL。3.如权利要求1-2任一所述的培养液，其特征在于，所述培养液为CZB、KSOM、HTF、M16、M2、TYH、M199、蔗糖溶液、MEMalpha。4.一种延缓体外培养卵子老化的方法，其特征在于，采用权利要求1-3任一所述的培养液体外培养卵子。5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，体外培养卵子的条件为：培养液pH值7.2-7.4、二氧化碳浓度2％-5％、湿度70％-100％、温度30-39℃的条件...

【专利技术属性】
技术研发人员：梁成光，温鑫，韩哲，程建响，赵庭，何东东，杨旻昊，
申请(专利权)人：内蒙古大学，
类型：发明
国别省市：内蒙古,15