一种芸薹链格孢及在制备抑菌剂中的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种芸薹链格孢Gb.PY‑F2及在制备抑菌剂中的应用，所述抑菌剂是芸薹链格孢Gb.PY‑F2经发酵培养获得的发酵液超声破碎后抽滤，取滤液经微孔滤膜过滤后浓缩，再用乙酸乙酯萃取，浓缩至恒重，获得芸薹链格孢Gb.PY‑F2代谢产物，即为抑菌剂。本发明专利技术提供一株新菌株‑‑银杏果内生真菌Gb.PY‑F2，芸薹链格孢Gb.PY‑F2代谢产物对金黄色葡萄球菌(CMCC(B)26003)的MIC＝1.5625mg/mL，通过微生物发酵得到具有抑菌活性的成分，产量大，工艺简单，更加安全，环保。

A Kind of Alternaria brassicae and Its Application in the Preparation of Antimicrobial Agents

The invention discloses an application of Alternaria brassicae Gb.PY_F2 in the preparation of bacteriostatic agent. The bacteriostatic agent is the fermentation liquid obtained by fermentation and culture of Alternaria brassicae Gb.PY_F2, which is broken by ultrasound, filtered by microporous membrane, concentrated by ethyl acetate, and concentrated to constant weight to obtain the metabolite of Alternaria brassicae Gb.PY F2, which is the bacteriostatic agent. The invention provides a new strain of Ginkgo biloba endophytic fungus Gb. PY F2, Brassica Alternaria Gb. PY F2 metabolite to the MIC of Staphylococcus aureus (CMCC (B) 26003) by microbial fermentation, which has bacteriostatic activity, high yield, simple process, safer and environmental protection.

【技术实现步骤摘要】
一种芸薹链格孢及在制备抑菌剂中的应用(一)
本专利技术涉及一种金黄色葡萄球菌抑菌剂，具体涉及一种内生真菌芸薹链格孢Gb.PY-F2及在制备抗金黄色葡萄球菌药物的应用。(二)
技术介绍
银杏是晚古生代的孑遗植物，具有“活化石”的美称，集食用、药用、绿化、观赏为一身。中国银杏种植面积位居世界首位，银杏叶产量约占全球总产量的70％。银杏种子甜而苦，与医药、食品同源，含有多种活性底物，如黄酮类、萜内酯、银杏酸、苯丙酮类、酚类等。因此，它具有促进唾液分泌、止渴祛痘、改善脑功能、增强记忆、治疗阿尔茨海默病、扩张微血管、促进血液循环、平滑血管、治疗脑供血等多种保健功能。银杏果一直被誉为高级滋补品，应用范围从食品领域扩展到医药、保健品、化妆品等领域。内生植物在各种植物中普遍存在。许多内生植物可以产生与宿主植物相同或相似的代谢产物，而且许多代谢产物是尚未发现的新物质。(三)
技术实现思路
本专利技术目的是提供一种芸薹链格孢Gb.PY-F2及在制备抑菌剂中的应用。本专利技术采用的技术方案是：本专利技术提供一种芸薹链格孢(Altemariabrassicae)Gb.PY-F2，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCCM219126，保藏日期为2019年3月6日，保藏地址为中国武汉武汉大学，邮编：430072。本专利技术所述芸薹链格孢Gb.PY-F2，菌落灰黑色，铺散状，菌落背面为黑色。本专利技术还提供一种所述芸薹链格孢Gb.PY-F2在制备抑菌剂中的应用，所述抑菌剂为金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)抑菌剂，优选金黄色葡萄球菌CMCC(B)26003。进一步，所述抑菌剂是芸薹链格孢Gb.PY-F2经发酵培养获得的发酵液超声破碎后抽滤，取滤液经微孔滤膜过滤后浓缩(优选浓缩至1/4体积)，再用乙酸乙酯萃取(优选萃取至乙酸乙酯相肉眼观察无明显颜色变化，合并乙酸乙酯萃取相)，有机相浓缩至恒重，获得芸薹链格孢Gb.PY-F2代谢产物，即为抑菌剂。更进一步，所述抑菌剂按如下方法制备：将芸薹链格孢Gb.PY-F2接种于发酵培养基中，28℃，180r/min培养7d，获得发酵液；将发酵液超声破碎后抽滤，取滤液经微孔滤膜过滤后浓缩至原体积的1/4，用1倍体积乙酸乙酯萃取至乙酸乙酯相肉眼观察无明显颜色变化，合并乙酸乙酯萃取相，浓缩至恒重，获得芸薹链格孢Gb.PY-F2粗提物，即为抑菌剂；所述发酵培养基组成：硝酸钠3g/L，磷酸氢二钾1g/L，硫酸镁(MgSO4·7H2O)0.5g/L，氯化钾0.5g/L，硫酸亚铁0.01g/L，蔗糖30g/L，溶剂为蒸馏水，pH7.0～7.2；利用高压蒸汽灭菌锅对其进行灭菌，条件为121℃，20分钟。进一步，所述超声破碎条件为：在405W条件下，每工作3s，间歇4s，进行300次循环。进一步，所述芸薹链格孢Gb.PY-F2发酵前先活化培养，然后再接入发酵培养基，所述活化培养为：将芸薹链格孢Gb.PY-F2接种于PDA培养基中，置于28℃恒温培养箱中培养7d；所述PDA培养基组成：马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，琼脂15～20g/L，溶剂为蒸馏水，自然pH。与现有技术相比，本专利技术有益效果主要体现在：本专利技术提供一株新菌株--芸薹链格孢Gb.PY-F2，通过微生物发酵得到具有抑菌活性的成分，芸薹链格孢Gb.PY-F2代谢产物对金黄色葡萄球菌(CMCC(B)26003)的MIC＝1.5625mg/mL。传统抑菌剂为抗生素，国内抗生素滥用情况普遍，现已加大管控，天然的抑菌剂将是未来市场的趋势，该抑菌剂产量大，工艺简单，更加安全，环保。(四)附图说明图1为Gb.PY-F2菌株形态。图2为Gb.PY-F2菌株系统发育树。图3为芸薹链格孢Gb.PY-F2发酵物乙酸乙酯萃取相的抗真菌活性抑菌圈照片；A为卡那霉素阳性对照；B为空白对照(DMSO)；C样品浓度为0.750mg/mL；D样品浓度为1.500mg/mL；E样品浓度为12.500mg/mL；F样品浓度为6.250mg/mL；G样品浓度为3.125mg/mL；H为空白对照(无菌超纯水)。(五)具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术进行进一步描述，但本专利技术的保护范围并不仅限于此：本专利技术所述银杏(学名：GinkgobilobaL.)，为银杏科、银杏属落叶乔木。银杏树的种子俗称白果，因此银杏又名白果树。本专利技术所述超纯水是指电阻率达到18MΩ*cm(25℃)的水。水中除了水分子外，几乎没有什么杂质，更没有细菌、病毒、含氯二噁英等有机物，也没有人体所需的矿物质微量元素。实施例1：芸薹链格孢Gb.PY-F2的典型分离1.植物样本采集：新鲜健康的银杏果采于江苏省无锡市惠山大道，银杏果用自来水清洗10分钟，然后用体积浓度75％乙醇水溶液漂洗一次。用质量浓度2％次氯酸钠水溶液浸泡10分钟后，用无菌水反复洗涤种子，再用体积浓度75％乙醇水溶液浸泡10分钟，然后用无菌水漂洗三次，合并漂洗液，用干燥的无菌吸收纸吸去表面水分，获得表面消毒后的银杏果。在超净工作台中，放置PDA培养基的无菌平板作为空白对照1，该对照为检查超净工作台的洁净程度；将漂洗液接种于PDA培养基的无菌平板作为空白对照2，该对照为漂洗液的检查；将表面消毒后的银杏果，置于PDA培养基的无菌平板中滚动后取出，作为空白对照3，该对照为植物组织印迹法筛选无菌的组织块。2.内生真菌的筛选以及分离纯化：于无菌超净工作台，将步骤1中表面消毒后的银杏果从中间切成薄片，作为无菌组织，然后接种在PDA培养基中，在28℃倒置培养，待出现菌丝沿着组织切口向外生长时，与空白对照1、2以及3均进行比较，采用尖端菌丝挑选的方法，将不同形态的菌落划线接种于PDA培养基中，待长出单菌落后，将单菌落再次划线接种于无菌PDA培养基中，反复多次接种，直到菌落形态一致且只有一种真菌生长时说明纯化完成，得到1株菌株为灰黑色，铺散状，菌落背面为黑色的真菌，见于图1，将该菌株记为菌株Gb.PY-F2。PDA培养基组成：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂15～20g，蒸馏水1000mL，自然pH。3.总DNA的提取：将菌株Gb.PY-F2接种于PDA培养基中，于28℃恒温培养箱中倒置培养7d。采用真菌基因组DNA快速抽提试剂盒(购自生工生物工程(上海)股份有限公司，产品编号：B518229)以及相关操作说明提取基因组DNA：①取50-100mg新鲜真菌或20mg干燥子实体或菌丝，液氮中充分研磨成粉末后放入到1.5mL离心管中，依次加入400μLBufferDigestion和4μlβ-巯基乙醇，震荡混匀。65℃水浴1h至细胞完全裂解。②加入200μlBufferPF，充分颠倒混匀，-20℃冰箱放置5min。③室温10000rpm离心5min，将上清液(500～550μl)转移到新的1.5ml离心管中。④加入等体积的异丙醇，颠倒5～8次使之充分混匀，室温放置2～3min。室温10000rpm离心5min，弃上清。⑤加入1ml75％乙醇，颠倒漂洗1～3min，10,000rpm离心2min，弃上清。⑥重复步骤⑤一次。⑦开盖室温倒置5～10min至残留的乙醇完全挥发。⑧得到的DNA用50-100μlTEBuffer溶解。提取的DNA可立即进行下一步实验或-本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种芸薹链格孢(Altemaria brassicae)Gb.PY‑F2，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC M 2019126，保藏日期为2019年3月6日，保藏地址：中国武汉，武汉大学，邮编：430072。

【技术特征摘要】
1.一种芸薹链格孢(Altemariabrassicae)Gb.PY-F2，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCCM2019126，保藏日期为2019年3月6日，保藏地址：中国武汉，武汉大学，邮编：430072。2.一种权利要求1所述芸薹链格孢Gb.PY-F2在制备抑菌剂中的应用。3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述抑菌剂为金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)抑菌剂。4.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述抑菌剂是芸薹链格孢Gb.PY-F2经发酵培养获得的发酵液超声破碎后抽滤，取滤液经微孔滤膜过滤后浓缩，再用乙酸乙酯萃取，有机相浓缩至恒重，获得芸薹链格孢Gb.PY-F2代谢产物，即为抑菌剂。5.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述抑菌剂按如下方法制备：将芸薹链格孢Gb.PY-F2接种于发酵培养基中，28℃，180r/min培养7d，获得发酵液；将发...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨胜利，潘芸，张慧，杨锡，邵泽辉，陈萍，
申请(专利权)人：浙江工业大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33