一种用于宫颈癌辅助诊断的免疫化学染色试剂盒制造技术

本发明专利技术涉及液基细胞学免疫细胞化学领域，具体涉及到一种用于宫颈癌辅助诊断的免疫组织化学试剂盒。本发明专利技术中提供了一种即用型抗体工作液，包括抗体试剂、牛血清白蛋白、非还原性糖、甜菜碱、环糊精、中性无机盐、表面活性剂、防腐剂；其中所述抗体试剂为试剂A或试剂B；所述试剂A为p16

【技术实现步骤摘要】
一种用于宫颈癌辅助诊断的免疫化学染色试剂盒
本专利技术涉及液基细胞学免疫细胞化学领域，具体涉及到一种用于宫颈癌辅助诊断的免疫化学染色试剂盒。
技术介绍
宫颈癌是妇科最常见的恶性肿瘤之一，其发病率仅次于乳腺癌并呈年轻化趋势，严重危害妇女身体健康。然而，宫颈癌又是唯一明确病因，有望成为第一个被人类攻克的肿瘤。因此，预防及早期筛查对降低宫颈癌的发病及死亡率具有重要意义。目前，宫颈癌诊断的主要方法有：宫颈脱落细胞学检查、人乳头瘤病毒(HPV)检测、阴道镜检查、病理活检等；中华医学会推荐的宫颈癌诊断三阶段程序为细胞学、阴道镜、宫颈组织活检。该诊断程序虽然有效，但也存在明显的局限性。阴道镜、组织活检是一种创伤性检查，给受检者带来一定痛苦，不适用于对所有病例进行筛查，应用范围比较小。而细胞学检测主要是通过病理医生对宫颈脱落细胞进行病理染色后再于显微镜下进行观察诊断。该方法操作较为简便，患者无痛苦，适合进行常规筛查。但受限于病理医生的经验，存在一定的假阳性和假阴性，造成部分高危患者的漏诊。因此，急需更加客观的肿瘤标志物的辅助诊断方法，提高细胞学筛查的敏感度和特异度。大量研究证实，大于90％的宫颈癌的发生与HPV的感染相关，HPV的E6、E7蛋白分别与P53的抑癌基因产物和pRb蛋白结合，影响与细胞周期和增殖相关的基因p16INK4a和Ki-67等的表达。P16INK4a基因是一种直接作用于细胞周期、抑制细胞分裂的抑癌基因，其过度表达与HPV感染密切相关，并已成为HPV感染转化的一个替代标志物。Ki-67是一种细胞增殖相关蛋白，只能在增殖细胞的细胞核中检出。因此，同一个正常宫颈上皮组织细胞中不会同时表达该两种蛋白。如果在宫颈上皮细胞中同时检测到p16INK4a和Ki-67的表达，则认为该细胞的周期调控出现失常，并以此作为宫颈上皮细胞转化状态的一个指标。另外，p16INK4a主要表达细胞核和细胞质，而Ki-67只在细胞核中表达，因此可以实现通过免疫组化实验检测宫颈癌组织细胞中两蛋白的共表达情况。大量研究表明p16INK4a和Ki-67免疫组化双染检出CIN2及以上宫颈癌病变的灵敏度较高，其特异性明显高于细胞学检查和高危HPV检测，能够降低误诊率，提高诊断阳性预测值。本专利技术要解决的技术问题是：当患者的高危HPV感染结果为阳性以及细胞学筛查诊断结果为非典型性鳞状细胞(ASCUS)或低鳞状上皮病变(LSIL)时，可以通过一种非创伤性且比较有效的检测方法对患者进行辅助诊断。同时，该检测方法要求操作简单方便，稳定性好，结果易于观察。
技术实现思路
针对上述问题，本专利技术的第一方面提供了一种即用型抗体工作液，包括抗体试剂、牛血清白蛋白、非还原性糖、甜菜碱、环糊精、表面活性剂；其中所述抗体试剂为试剂A或试剂B；所述试剂A为p16INK4a单克隆抗体和Ki-67单克隆抗体的PBS缓冲溶液；所述试剂B为辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗和碱性磷酸酶标记的羊抗兔二抗的PBS缓冲溶液；所述PBS缓冲溶液的pH值为7.2～7.8。作为一种优选的技术方案，所述即用型抗体工作液包括pH值为7.2～7.8的PBS缓冲溶液、p16INK4a单克隆抗体、Ki-67单克隆抗体、牛血清白蛋白、非还原性糖、甜菜碱、环糊精、表面活性剂；其中，所述p16INK4a抗体浓度为0.1-1.2mg/L；所述Ki-67抗体浓度为0.1-1.3mg/L；所述牛血清白蛋白浓度为0.2-2.5g/L；所述非还原性糖浓度为1-8g/L；所述甜菜碱浓度为2-4g/L；所述环糊精浓度为0.1-2.5g/L；所述表面活性剂含量0.01-1wt％。作为一种优选的技术方案，所述即用型抗体工作液包括pH值为7.2～7.8的PBS缓冲溶液、辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗、碱性磷酸酶标记的羊抗兔二抗、牛血清白蛋白、非还原性糖、甜菜碱、环糊精、表面活性剂；其中，所述辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗浓度为0.5-4mg/L；所述碱性磷酸酶标记的羊抗兔二抗浓度为1-4mg/L；所述牛血清白蛋白浓度为0.2-2.5g/L，所述非还原性糖浓度1-8g/L；所述甜菜碱浓度2-4g/L；所述环糊精浓度0.1-2g/L；所述表面活性剂含量0.01-0.5wt％。作为一种优选的技术方案，所述表面活性剂为非离子型表面活性剂；所述非离子型表面活性剂为脂肪酸酯类表面活性剂。作为一种优选的技术方案，所述非还原性糖为海藻糖和/或蔗糖。本专利技术的第二个方面提供了一种用于宫颈癌辅助诊断的免疫化学染色试剂盒，包括如上所述的即用型抗体工作液、快速无蛋白封闭液、稳定型辣根过氧化物酶显色试剂、即用型碱性磷酸酶显色试剂、水性封片剂。作为一种优选的技术方案，所述快速无蛋白封闭液包含缓冲溶液、海藻糖、PEG、PVP、吐温；其中所述缓冲溶液为pH值为7.2～7.8的PBS缓冲液或Tris-HCl缓冲液；所述海藻糖浓度1-25g/L；所述PEG和PVP的浓度为0-12g/L，且不同时为零；所述吐温含量0.1-5wt％。本专利技术的第三个方面提供了如上所述的用于宫颈癌辅助诊断的免疫化学染色试剂盒的使用方法，包括如下步骤：1)取样本制成细胞涂片并且固定，然后用过氧化氢处理，并室温孵育10min；2)对第一步前处理得到的细胞涂片用快速无蛋白封闭液进行封闭5-30min，然后去除快速无蛋白封闭液，用含有p16INK4a单克隆抗体和Ki-67单克隆抗体的如上所述的即用型抗体工作液37℃孵育30-80min，PBS缓冲液洗涤；然后用含有羊抗鼠二抗和羊抗兔二抗的如上所述的即用型抗体工作液37℃孵育5-40min，PBS缓冲液洗涤；3)取稳定型辣根过氧化物酶显色试剂滴加到待测样品上，37℃避光孵育，然后用显微镜观察显色至细胞质棕色信号强度，PBS缓冲液洗涤停止显色，然后用即用型碱性磷酸酶显色试剂滴加到待测样品上，37℃避光孵育，显微镜下观察显色至细胞核蓝紫色信号强度，PBS缓冲液洗涤停止显色；然后苏木素复染，洗涤后水性封片剂封片，显微镜下观察；4)结果判定标准：p16INK4a/Ki-67双染阳性细胞表现为细胞质棕色且细胞核蓝紫色；仅细胞核蓝紫色或仅细胞质及细胞核棕色，以及细胞未显色均为阴性；当涂片中出现一个或多个双染阳性细胞即判定为该病例为双染阳性。作为一种优选的技术方案，第3步中所述稳定型辣根过氧化物酶显色试剂包括：DAB反应液，DAB底物(20倍)，DAB色原(20倍)。作为一种优选的技术方案，第一步中所述固定过程采用95～99wt％乙醇或4wt％多聚甲醛。有益效果：本试剂盒组分较少，采用即用设计，各组分使用方便，极大简化了繁杂的免疫组化操作。其中即用型抗体工作液中包含优化后的高质量的抗体以及多种抗体保护成分，使用方便，易于保存，可以长期存储于2-8℃而保持质量稳定。使用时无需稀释，直接滴加在样本上即可，方便快捷。快速无蛋白封闭液用无动物来源的小分子成分配制，封闭速度快，背景低，并在一定程度上提升信号强度。该专利技术对显色方式也进行了极大的改良，可节省操作时间，节约成本，方便观察双染结果，减少阳性漏判及误判的概率。其中棕色细胞质信号和蓝紫色细胞核信号叠加可形成鲜明对比。稳定型辣根过氧化物酶显色试剂可将阳性细胞的细胞质催化形成棕色信号，而即用型碱性磷酸酶显色试剂可将阳本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种即用型抗体工作液，其特征在于，包括抗体试剂、牛血清白蛋白、非还原性糖、甜菜碱、环糊精、表面活性剂；其中所述抗体试剂为试剂A或试剂B；所述试剂A为p16

【技术特征摘要】
1.一种即用型抗体工作液，其特征在于，包括抗体试剂、牛血清白蛋白、非还原性糖、甜菜碱、环糊精、表面活性剂；其中所述抗体试剂为试剂A或试剂B；所述试剂A为p16INK4a单克隆抗体和Ki-67单克隆抗体的PBS缓冲溶液；所述试剂B为辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗和碱性磷酸酶标记的羊抗兔二抗的PBS缓冲溶液；所述PBS缓冲溶液的pH值为7.2～7.8。2.如权利要求1所述的即用型抗体工作液，其特征在于，包括pH值为7.2～7.8的PBS缓冲溶液、p16INK4a单克隆抗体、Ki-67单克隆抗体、牛血清白蛋白、非还原性糖、甜菜碱、环糊精、表面活性剂；其中，所述p16INK4a抗体浓度为0.1-1.2mg/L；所述Ki-67抗体浓度为0.1-1.3mg/L；所述牛血清白蛋白浓度为0.2-2.5g/L；所述非还原性糖浓度为1-8g/L；所述甜菜碱浓度为2-4g/L；所述环糊精浓度为0.1-2.5g/L；所述表面活性剂含量0.01-1wt％。3.如权利要求1所述的即用型抗体工作液，其特征在于，包括pH值为7.2～7.8的PBS缓冲溶液、辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗、碱性磷酸酶标记的羊抗兔二抗、牛血清白蛋白、非还原性糖、甜菜碱、环糊精、表面活性剂；其中，所述辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗浓度为0.5-4mg/L；所述碱性磷酸酶标记的羊抗兔二抗浓度为1-4mg/L；所述牛血清白蛋白浓度为0.2-2.5g/L，所述非还原性糖浓度1-8g/L；所述甜菜碱浓度2-4g/L；所述环糊精浓度0.1-2g/L；所述表面活性剂含量0.01-0.5wt％。4.如权利要求3所述的即用型抗体工作液，其特征在于，所述表面活性剂为非离子型表面活性剂；所述非离子型表面活性剂为脂肪酸酯类表面活性剂。5.如权利要求1所述的即用型抗体工作液，其特征在于，所述非还原性糖为海藻糖和/或蔗糖。6.一种用于宫颈癌辅助诊断的免疫化学染色试剂盒，其特征在于，包括如权利要求2和3所述的即用型抗体工作液、快速无蛋白封闭液、稳定型辣根过氧化物酶显色试剂、即用型碱性磷...

【专利技术属性】
技术研发人员：肖国林，
申请(专利权)人：湖北泰康医疗设备有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北,42