重组质粒及其制备方法和利用其制备的能表达耐高温α-淀粉酶的细胞的制备方法及应用技术

本发明专利技术公开了一种重组质粒及其制备方法和利用其制备的能表达耐高温α‑淀粉酶的细胞的制备方法及应用。首先制备含有P43启动子和lacO与lacI基因的重组质粒；再将耐高温α‑淀粉酶基因连接至重组质粒当中，质粒中含有枯草芽孢杆菌强启动子P43，大大提高了耐高温α‑淀粉酶的产量，同时质粒中含有的lacO与lacI基因序列，可以使用IPTG进行诱导表达，相比于微生物诱变育种更加的快捷和目的性；然后将受体细胞和和含有耐高温α‑淀粉酶基因的载体通过电击转化之后即可得到得到能表达耐高温α‑淀粉酶的细胞。当使用枯草芽孢杆菌为受体细胞时，其基因信息明确，生产速度快，培养密度大，可提耐高温α‑淀粉酶的产量和酶活力。

Recombinant plasmid and its preparation method and the preparation and application of heat-resistant alpha-amylase-expressing cells prepared by the recombinant plasmid

The invention discloses a recombinant plasmid and a preparation method thereof, and a preparation method and application of a cell capable of expressing heat-resistant alpha amylase prepared by the recombinant plasmid. Firstly, the recombinant plasmid containing P43 promoter and lacO and lacI gene was prepared, and then the thermostable alpha amylase gene was linked to the recombinant plasmid. The plasmid contained strong promoter P43 of Bacillus subtilis, which greatly increased the production of thermostable alpha amylase. At the same time, the lacO and lacI gene sequences contained in the plasmid could be induced by IPTG, compared with microbial mutagenesis. It is more rapid and objective; then, the receptor cells and the carriers containing heat-resistant alpha amylase gene can be transformed into heat-resistant alpha amylase cells by electric shock. When Bacillus subtilis is used as the recipient cell, its gene information is clear, the production speed is fast, the culture density is high, and the production and enzyme activity of heat-resistant alpha amylase can be improved.

【技术实现步骤摘要】
重组质粒及其制备方法和利用其制备的能表达耐高温α-淀粉酶的细胞的制备方法及应用
本专利技术属于生物基因工程
，具体涉及一种重组质粒及其制备方法和利用其制备的能表达耐高温α-淀粉酶的细胞的制备方法及应用。
技术介绍
高温α-淀粉酶是一种广泛分布于动植物和微生物中，能水解淀粉、糖原等的α-1,4糖苷键，生成糊精和还原糖的一种酶，由于产物的末端残基的碳原子构型为α构型，所以称为高温α-淀粉酶。1872年芽孢杆菌作为一个表达宿主菌首次被提出。目前人们已经对芽孢杆菌进行了大量研究，尤其是在菌种改良、遗传操作、感受态、芽孢形成及其调控等领域进行了大量的工作。可以作为宿主表达外源基因的芽孢杆菌有枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、球形芽孢杆菌等。芽孢杆菌拥有一套高效的分泌信号肽及分子伴侣系统，利用这些元件，可以完成目的蛋白的高效分泌表达。芽孢杆菌作为一种表达宿主菌，各国已经进行了广泛而深入的研究。芽孢杆菌可以作为多种原核生物、真核生物和哺乳动物等来源的蛋白的表达宿主，有的已经投入大规模生产。解淀粉芽孢杆菌曾经作为中温α-淀粉酶的生产工程菌，但是在培养的后期，营养结构变本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种重组质粒，其特征在于，所述重组质粒以枯草芽孢杆菌‑大肠杆菌穿梭质粒pBE2载体为骨架，并在其EcoRI和BamHI的多克隆位点处插入P43启动子和lacO基因，以及在其NheI及PvuI的多克隆位点处插入LacI基因。

【技术特征摘要】
2018.12.22 CN 20181157597131.一种重组质粒，其特征在于，所述重组质粒以枯草芽孢杆菌-大肠杆菌穿梭质粒pBE2载体为骨架，并在其EcoRI和BamHI的多克隆位点处插入P43启动子和lacO基因，以及在其NheI及PvuI的多克隆位点处插入LacI基因。2.根据权利要求1所述的重组质粒，其特征在于，所述重组质粒的序列如SEQIDNO：3所示。3.根据权利要求1或2所述的重组质粒的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：(1)以枯草芽孢杆菌-大肠杆菌穿梭质粒pBE2载体为骨架，使用EcoRI以及BamHI进行过夜双酶切，酶切后对质粒片段进行回收；(2)以枯草芽孢杆菌为模板，使用含有EcoRI酶切位点的引物P1和含有lacO以及BamHI酶切位点的引物P2对P43启动子序列进行扩增，得到连接了启动子P43的lacO基因；(3)将步骤(1)得到的质粒片段与连接了启动子P43的lacO基因使用T4连接酶连接，得到了连接了启动子P43和lacO基因的质粒；(4)以Pet28a质粒为模板，使用含有NheI酶切位点的引物P3及含有PvuI酶切位点的引物P4对LacI基因进行扩增；(5)使用NheI以及PvuI对步骤(3)得到的质粒进行双酶切，并将其与步骤(4)中得到的LacI基因使用T4连接酶进行过夜连接，连接后转入大肠杆菌DH5a进行培养，之后使用新霉素抗性基因筛选单克隆进行测序，即可得到所述重组质粒。4.一种能表达耐高温α-淀粉酶的细胞的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：(a)将耐高温α-淀粉酶基因连接至权利要求1或2所述的重组质粒中，并将连接后的产物转化至大肠杆菌DH5a，使用新霉素进行抗性筛选得到含有耐高温α-淀粉酶基因的载体；(b)将受体细胞和含有耐高温α-淀粉酶基因的载体通过电击转化之后即可得到得到能表达耐高温α-淀粉酶的细胞。5.根据...

【专利技术属性】
技术研发人员：周辉，
申请(专利权)人：广州睿辰生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44