用于检测狂犬病毒抗体的抗原蛋白的制备方法及试剂盒技术

本发明专利技术涉体外诊断试剂技术领域，具体涉及一种用于检测狂犬病毒抗体的抗原蛋白的制备方法及试剂盒，本发明专利技术含狂犬病毒G蛋白表达框的重组杆状病毒感染昆虫细胞，得到感染的昆虫细胞；将感染后的昆虫细胞培养进行培养增殖；由昆虫细胞中提取狂犬病毒抗体的抗原蛋白，并用抗原蛋白制作了试剂盒，解决了用传统方法狂犬病毒全病毒颗粒作为包被抗原，抗体检测结果中因含有中和抗体和非中和抗体，不能准确反映体内有效保护性抗体真实水平的问题，本发明专利技术可规模化生产，检测其它传染病阳性血清，无交叉反应，特异性强，灵敏度高，重复性好，线性范围宽，避免了生物安全风险，具有很强的创造性。

Preparation and Kit of Antigen Protein for Detecting Rabies Virus Antibody

The invention relates to the technical field of in vitro diagnostic reagents, in particular to the preparation method and kit of an antigen protein for detecting rabies virus antibody. The recombinant baculovirus containing the expression frame of rabies virus G protein infects insect cells and obtains infected insect cells; cultures and proliferates infected insect cells; extracts rabies virus antibody from insect cells. Antigen protein and antigen protein kit were made to solve the problem that rabies virus particles were used as coated antigens by traditional methods. Because of containing neutralizing antibody and non-neutralizing antibody, the real level of effective protective antibody in vivo could not be accurately reflected. The present invention can be produced on a large scale to detect positive serum of other infectious diseases without cross reaction and specificity. It has strong sensitivity, good repeatability, wide linear range, avoids the risk of biosafety, and has strong creativity.

【技术实现步骤摘要】
用于检测狂犬病毒抗体的抗原蛋白的制备方法及试剂盒
本专利技术涉医疗用品
，具体涉及一种用于检测狂犬病毒抗体的抗原蛋白的制备方法及试剂盒。
技术介绍
狂犬病(又称恐水症)是由狂犬病毒(Rabiesvirus，RV)引起的人兽共患传染病，一旦发病，病死率几乎100％，是人类病死率最高的急性传染病。狂犬病毒外形呈子弹状，是单股负链RNA病毒。病毒基因组长约12kb,由3’端至5’端依次排列着N、P、M、G、和L五个狂犬病毒的结构蛋白，分别编码核蛋白、磷蛋白、基质蛋白、糖蛋白、和大转录酶蛋白。糖蛋白与狂犬病毒的感染与免疫有关，它是以上五种蛋白中唯一能刺激机体产生中和抗体的蛋白。狂犬病呈全球性分布，家养动物是主要传染源。世界卫生组织估计，全球每年死于狂犬病的人数超过5.5万人，其中99％以上发生在发展中国家。儿童是受狂犬病危害最大的群体。狂犬病毒严重威胁着人类的健康。目前狂犬疫苗是抵御狂犬病毒的最有效的手段，随着近年生物技术的不断发展，人类对新型疫苗的研制取得了显著的成果，安全有效的人用狂犬疫苗的出现，为人类抵御狂犬病毒提供了更有效的保护。为了预防狂犬病的发生，在危险动物致伤后，可通过注射被动免疫制剂和接种狂犬疫苗进行预防，然而并非完成狂犬疫苗的接种就一定能够获得足够且有效的抗体来抵御病毒的感染，防止发病。由于个体免疫水平的差异、疫苗质量、接种程序的规范与否以及随时间推移抗体水平的逐渐下降等原因，疫苗接种后，大部分人群获得了免疫保护，但仍有部分人群可能由于以上原因导致抗体水平低下，无法抵御狂犬病毒的侵袭。通过对狂犬病毒相应抗体开展抗体检测，跟踪患者血清中和抗体水平，评价暴露前免疫力及暴露后治疗过程中疫苗免疫力的效果，对抗体水平不足的人群进行有针对性的补种，对减轻患者的心理负担、预防狂犬病的发生、保护相关人群的健康有着十分重要的意义。目前检测狂犬病毒抗体的方法主要有4种，包括荧光抗体病毒中和试验(FAVN)、快速荧光灶抑制试验(RFFIT)、小鼠中和试验(MNT)、酶联免疫吸附试验(ELISA)。其中，快速荧光灶抑制试验(RFFIT)被WHO和《中华人民共和国药典2010版》均采纳作为检测狂犬病毒中和抗体的金标准方法。快速荧光灶抑制试验(RFFIT)作为检测狂犬病毒中和抗体的金标准方法，具有以下特点：可定量检测人血清中狂犬病毒中和抗体，可真实反映体内有效抵御病毒感染抗体水平高低，结果比较真实可靠。但是，由于该试验方法操作非常繁琐，需经过严格专业培训的技术人员才能胜任此项检测工作，试验周期较长，另外该试验过程中需要制备病毒悬液，存在生物安全性问题，对设备要求高，需配备荧光显微镜，价格昂贵。荧光抗体病毒中和试验(FAVN)、小鼠中和试验(MNT)同样存在对技术人员要求高，需制备病毒悬液，并且检测耗时长，不利于快速诊断和大规模样本的检测。酶联免疫吸附试验(ELISA)具有操作简便、灵敏度高、特异性强、检测耗时短、对设备要求不高，适用于大量样本的检测等显著优势，同样可用于定量检测人血清中狂犬病毒抗体的含量。市面上现有的用于狂犬病毒抗体检测的试剂盒(酶联免疫法)所用的抗原通常都为狂犬病毒全病毒颗粒，而用狂犬病毒全病毒颗粒作为试剂盒的包被板抗原，最大的缺陷是检测到的抗体为全病毒抗体，它包括中和抗体和非中和抗体。因为只有中和抗体才能够抵抗狂犬病毒入侵，阻止狂犬病的发生，而非中和抗体不能抵抗狂犬病毒入侵。世界卫生组织(WHO)狂犬病专家委员会认为，只有血清中的中和抗体效价≥0.5IU/ml才具有足够的保护性，如果效价＜0.5IU/ml，必须加强剂量，直到中和抗体效价达到要求的水平。因此只有特异性检测狂犬病毒的中和抗体才能反映体内真实的抗体保护水平。G蛋白是狂犬病毒的糖蛋白，其与狂犬病毒的感染与免疫有关，也是狂犬病毒编码的五种结构蛋白中唯一能刺激机体产生中和抗体的蛋白。狂犬病毒G蛋白上存在GⅠ、GⅡ和GⅢ这3个主要的中和抗体结合位点。有研究者尝试用基因工程的方法，利用原核表达系统成功表达出G蛋白，用作检测狂犬病毒抗体的抗原蛋白原料，制备成狂犬病毒抗体检测试剂盒(酶联免疫法)用于狂犬病毒中和抗体的检测，但检测结果跟狂犬病毒中和抗体检测金标准方法快速荧光灶抑制试验(RFFIT)对比，前者普遍存在明显的漏检和假阴性现象，导致抗体检测结果不准确，不能真实反映体内中和抗体水平。存在此缺陷主要是因为，目的蛋白G蛋白是一种糖蛋白，在其表达及分泌的过程中，充分的糖基化修饰对其稳定性、抗原性及生物活性有着至关重要的作用，而原核表达系统缺乏较完整的翻译后修饰功能，表达出的G蛋白构象与天然构象差距较大，因此将其表达的G蛋白作为检测狂犬病毒中和抗体的诊断抗原原料，不能准确反映出血清中狂犬病毒中和抗体的真实水平。因此，需要一种新的狂犬病毒抗体检测试剂盒。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种可规模化生产，检测其它传染病阳性血清，无交叉反应，特异性强，灵敏度高，重复性好，线性范围宽，避免了生物安全风险的用于检测狂犬病毒抗体的抗原蛋白的制备方法及试剂盒。本专利技术解决上述技术问题的技术方案如下：一种用于检测狂犬病毒抗体的抗原蛋白的制备方法，包括以下步骤：S1：将重组杆状病毒感染昆虫细胞；S2：将感染后的昆虫细胞进行培养增殖；S3：由培养增殖后的昆虫细胞中提取狂犬病毒抗体的抗原蛋白。本专利技术的有益效果是：本专利技术所述的包被抗原G蛋白为狂犬病毒的糖蛋白，是唯一能激发体内细胞免疫，诱导产生中和抗体的结构蛋白。用重组的G蛋白作为试剂盒包被板的包被抗原，首先它解决了用传统方法狂犬病毒全病毒颗粒作为包被抗原，抗体检测结果中因含有中和抗体和非中和抗体，不能准确反映体内有效保护性抗体真实水平的问题。其次，在制备重组G蛋白和抗体检测试验操作中，不会涉及狂犬病毒活毒，避免了生物安全风险。更进一步的，所述S3中，包括以下步骤：S31将病变的昆虫细胞800g离心5min沉淀收集昆虫细胞；S32使用100mL含20mmol咪唑的磷酸盐缓冲液重悬昆虫细胞，高压匀浆破碎昆虫细胞；S33将S32中的昆虫细胞12000g离心20min，弃沉淀，昆虫细胞破碎离心后的上清和昆虫细胞培养物上清经0.45μm滤膜过滤；S34将过滤后的细胞裂解液上清和培养物上清过柱，再次平衡层析柱；S35用含200mmol咪唑的磷酸盐缓冲液洗脱过柱后的昆虫细胞破碎离心后的上清和昆虫细胞培养物上清，在仪器显示UV值的波峰处提取并收集目的抗原蛋白，向所述抗原蛋白中加入终浓度为10％的甘油，调整抗原蛋白浓度为1mg/mL，并于-80℃对所述抗原蛋白进行贮存。更进一步的有益效果是：本专利技术所述的昆虫细胞悬浮培养工艺，细胞培养密度高，较传统的贴壁静置培养方法，可显著提高外源蛋白表达水平。从破碎后的细胞上清和培养液上清均能中纯化出目的蛋白G蛋白，蛋白浓度高达3.5mg/L以上。一种用于检测狂犬病毒抗体的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒使用上述制备方法制备的抗原蛋白。所述试剂盒包括以下试剂：含有所述抗原蛋白的溶液，ELISA板，酶标记物，系列校准品，样品稀释液，浓缩洗涤液和显色试剂。包括以下试剂：用所述抗原蛋白包被的抗原包被板，酶标记物，系列校准品，样品稀释液，浓缩洗涤液和显色试剂。本专利技术试剂盒可规模化生产，检测其它传染本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于检测狂犬病毒抗体的抗原蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：S1：将重组杆状病毒感染昆虫细胞；S2：将感染后的昆虫细胞进行培养增殖；S3：由培养增殖后的昆虫细胞中提取狂犬病毒抗体的抗原蛋白。

【技术特征摘要】
1.一种用于检测狂犬病毒抗体的抗原蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：S1：将重组杆状病毒感染昆虫细胞；S2：将感染后的昆虫细胞进行培养增殖；S3：由培养增殖后的昆虫细胞中提取狂犬病毒抗体的抗原蛋白。2.根据权利要求1所述的用于检测狂犬病毒抗体的抗原蛋白的制备方法，其特征在于，所述S1中，将含有狂犬病毒中和抗体结合位点的G蛋白基因片段克隆至杆状病毒表达载体并感染昆虫细胞，所述昆虫细胞为Sf9细胞。3.根据权利要求2所述的用于检测狂犬病毒抗体的抗原蛋白的制备方法，其特征在于，所述含有狂犬病毒中和抗体结合位点的G蛋白基因片段的DNA编码序列为SEQIDNO:1序列。4.根据权利要求2所述的用于检测狂犬病毒抗体的抗原蛋白的制备方法，其特征在于，所述S1包括以下步骤：S11：将Sf9细胞经克氏瓶静置培养复苏；S12：对复苏后的Sf9细胞进行传代培养，传代后初始密度不低于2.5×105个/mL的接种量并逐步放大接种量至摇瓶培养；S13：当Sf9细胞生长密度达到2.0×106个/mL以上时，用携带G蛋白表达框的杆状病毒表达载体感染所述Sf9细胞。5.根据权利要求1所述的用于检测狂犬病毒抗体的抗原蛋白的制备方法，其特征在于，其特征在于，S2中，所述感染后的昆虫细胞培养96-108h，至80％以上的昆虫细胞出现明显病变。6.根据权利要求1所述的用于检测狂犬病毒抗体的抗原蛋白的制备方法，其特征在于，所述S3中，包括以下步骤：S31将病变的昆虫细胞800g离心5min沉淀收集昆虫细胞；S32使用100mL含20mmol咪唑的磷酸盐缓冲液重悬昆虫细胞，高压匀浆破碎昆虫细胞；S33将S32中的昆虫细胞12000g离心20min，弃沉淀，昆虫细胞破碎离心后的上清和昆虫细胞培养物上清经0.45μm滤膜过滤；S34将过滤后的细胞裂解液上清和培养...

【专利技术属性】
技术研发人员：华俊清，曾强，黄晶，王诺，项雅丽，吴边，
申请(专利权)人：武汉生命科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北,42