一种用于活体的三维网络生物探针及其制备方法与应用技术

本发明专利技术公开了一种用于活体的三维网络生物探针及其制备方法与应用，属于生物、化学及材料领域。通过在金纳米管修饰的三维网络材料上修饰上生物分子，再将其裁剪成长条状拖拽嵌入中空细管使其部分裸露在细管外部，得到用于活体的三维网络生物探针。本发明专利技术的探针可广泛应用到生物医学中，如活体血液中循环肿瘤细胞等特定细胞的分离、外泌体的分离、游离RNA的分离、蛋白的分离等；其使用方法为：将将留置针穿刺进入活体静脉血管，拔出留置针的钢针，将探针封闭后通过留置针的软管插入到血管之中，后端用肝素帽密封。本发明专利技术探针具有三维网络结构、强韧性、生物相容性好等优点，其既可以固定大量的生物分子，又可以在激光照射下可产生光热效应。

A three-dimensional network bioprobe for living organisms and its preparation method and Application

The invention discloses a three-dimensional network biological probe for living organisms, a preparation method and application thereof, belonging to the field of biology, chemistry and materials. Biomolecules were modified on the three-dimensional network materials modified by gold nanotubes, and then cut into strips and dragged into hollow tubules to expose part of them outside the tubules. A three-dimensional network bioprobe for living organisms was obtained. The probe of the invention can be widely applied in biomedicine, such as the separation of specific cells such as circulating tumor cells in living blood, the separation of exosomes, the separation of free RNA, the separation of protein, etc. The method of using the probe is to puncture the indwelling needle into the living vein and blood vessel, pull out the steel needle of the indwelling needle, insert the probe into the blood vessel through the indwelling needle's soft tube after sealing, and insert the back end of the probe into the blood vessel. Seal with heparin cap. The probe of the invention has the advantages of three-dimensional network structure, strong toughness and good biocompatibility. It can fix a large number of biological molecules and produce photothermal effect under laser irradiation.

【技术实现步骤摘要】
一种用于活体的三维网络生物探针及其制备方法与应用
本专利技术属于生物、化学及材料领域，具体涉及一种用于活体的三维网络生物探针及其制备方法与应用。
技术介绍
循环肿瘤细胞是由癌症病人的原发病灶或者转移病灶脱落进入外周血液循环系统的肿瘤细胞，循环肿瘤细胞是一种重要的癌症标志物，对于癌症的早期检测、手术预后、药物敏感性测试等个性化诊疗具有重要意义。当前针对循环肿瘤细胞的检测多集中于体外少量血液样本的检测分析，可用于活体内捕获循环肿瘤细胞的技术还鲜有报道公开。活体内检测理论上可以检测分析全身所有血液，其灵敏度远远高于体外检测技术。活体内检测肿瘤细胞可以在循环肿瘤细胞数目低于1个/mL时，实现对肿瘤细胞的检测。然而现在极其缺乏有效的活体内检测技术，亟需开发简单、高效、快速的分离循环肿瘤细胞的方法，以实现真正的癌症早期检测。循环肿瘤细胞随血液循环转移到远端器官形成肿瘤转移病灶，在杀伤原位肿瘤的同时，辅以对血液中循环肿瘤细胞的杀伤，可能有效抑制肿瘤转移灶的形成，从而取得更好的抗肿瘤效果。当前的肿瘤治疗策略多针对肿瘤本身而忽略血液中循环肿瘤细胞的杀伤，亟待开发可以在活体内长时间有效杀伤循环肿瘤细胞的方法。
技术实现思路
本专利技术的首要目的在于克服现有技术存在的缺点与不足，提供一种用于活体的三维网络生物探针的制备方法及通过该方法得到的三维网络生物探针。本专利技术的另一目的在于提供所述三维网络生物探针的应用。本专利技术的再一目的在于提供所述三维网络生物探针的使用方法。本专利技术的目的通过下述技术方案实现：一种用于活体的三维网络生物探针载体材料的制备方法，包括如下步骤：(1)将泡沫金属浸入到液态高分子材料中，离心使高分子材料充分填充泡沫金属的空隙；再次离心，除去泡沫金属空隙中多余的高分子材料；将表面包裹高分子材料的泡沫金属加热固化；浸入到酸性溶液中除去泡沫金属，用水漂洗，烘干，得到三维网络材料。其中，高分子材料包括聚二甲基硅氧烷(PDMS)、纤维素、壳聚糖、甲壳素、PMMA等；第一次离心的条件优选为3000-8000rpm离心1-10min，第二次离心的条件优选为1000-5000rpm离心1-10min；浸入到酸性溶液中除去泡沫金属的条件优选为浸入到5-14mol/L的酸性溶液中1-12h，酸性溶液包括硝酸、盐酸、硫酸等。(2)将三维网络材料用O2plasma处理后浸入到多巴胺的Tris-HCl溶液中进行反应，反应结束后取出材料用水漂洗，得到聚多巴胺修饰的三维网络材料。其中，三维网络材料用O2plasma处理的时间优选为1-10min；多巴胺的Tris-HCl溶液中多巴胺的浓度优选为0.1-10mg/mL，Tris-HCl的浓度优选为0.001-0.01mol/L、pH优选为7-12；进行反应的条件优选为静置反应1-24h。(3)将聚多巴胺修饰的三维网络材料浸入到银纳米线异丙醇溶液(银纳米线分散到异丙醇中得到)中进行反应，反应结束后取出材料挥发掉其中的异丙醇，得到银纳米线修饰的三维网络材料。其中，银纳米线异丙醇溶液的浓度优选为0.1-10mg/mL；进行反应的条件优选为静置反应1-100min。(4)将银纳米线修饰的三维网络材料浸入到[Au(en)2]Cl3水溶液中进行金-银置换反应，反应结束后取出材料用水漂洗、烘干，得到金纳米管修饰的三维网络材料，即得到三维网络生物探针载体材料。其中，[Au(en)2]Cl3水溶液的浓度优选为1-10mmol/L；金-银置换反应的条件优选为在鼓风干燥机中于1-100℃反应1-50h。一种三维网络生物探针载体材料，通过上述制备方法得到。一种三维网络生物探针材料的制备方法，包括如下步骤：(1)将上述制备的金纳米管修饰的三维网络材料浸入到巯基乙酸溶液中避光反应，反应结束后取出修饰有巯基乙酸的金纳米管修饰的三维网络材料，用PBS漂洗后浸泡在PBS中备用。其中，巯基乙酸溶液的浓度优选为1-100nmol/L；避光反应的条件优选为1-50h。(2)将步骤(1)得到的三维网络材料用化学交联剂活化后，浸入到生物分子溶液中进行孵育，再经PBS充分洗涤后得到生物分子功能化修饰的三维网络生物探针材料。其中，用交联剂活化优选在含有1-50mmol/L1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)和1-50mmol/LN-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的混合溶液中活化，活化时间优选为10-100min；生物分子溶液的浓度优选为1～500mg/mL；孵育的时间优选为1～24h。所述的生物分子优选为用于特异性识别和捕获生物分子或细胞的蛋白或核酸，如特异性抗体、核酸适配体、链霉亲和素、凝集素、生长因子等。一种三维网络生物探针材料，通过上述制备方法得到。一种用于活体的三维网络生物探针的制备方法，包括如下步骤：将上述制备的生物分子功能化修饰的三维网络生物探针材料裁剪成1-5mm宽、1-10mm长、高0.5-3mm的长条状，用细线将裁剪好的材料一端拖拽嵌入直径为0.3-3mm、长度为3-10cm的中空细管之中，以使裁剪好的三维网络材料一部分嵌入到细管之中，另一部分裸露在细管外部1-5mm，使三维网络生物探针材料固定在细管的一端，得到用于活体的三维网络生物探针。其中，所述的细管包括中空的钢针、玻璃毛细管等。一种用于活体的三维网络生物探针，通过上述制备方法得到。所述的三维网络生物探针可广泛应用到生物医学中，根据所修饰的生物分子不同可用于不同的用途，如活体血液中循环肿瘤细胞等特定细胞的分离、外泌体的分离、游离RNA的分离、蛋白的分离等。所述的三维网络生物探针的使用方法，包括如下步骤：将留置针穿刺进入活体静脉血管，之后拔出留置针的钢针，留下留置针的外层软管，将三维网络生物探针封闭后通过留置针的软管插入到血管之中，使三维网络生物探针前端的三维网络材料暴露在血管里的血液中，后端用肝素帽密封。所述的留置针的直径优选为0.3-3mm。当所述的三维网络生物探针修饰的生物分子为特异性识别和捕获肿瘤细胞的生物分子，如抗上皮细胞粘附因子抗体时，则其可用于循环肿瘤的分离、原位杀伤。一种基于上述三维网络生物探针分离血液中循环肿瘤细胞的方法，包括如下步骤：(1)将修饰有特异性识别和捕获肿瘤细胞的生物分子的三维网络生物探针浸入到含牛血清白蛋白和表面活性剂的溶液中孵育封闭，之后PBS漂洗。其中，含牛血清白蛋白和表面活性剂的溶液中牛血清白蛋白的浓度优选为1-10％，表面活性剂的浓度优选为0.1-10％，表面活性剂包括血清、吐温、脱脂奶粉等；孵育封闭的时间优选为1-1000min。(2)将留置针穿刺进入活体静脉血管，之后拔出留置针的钢针，留下留置针的外层软管。将步骤(1)封闭后的三维网络生物探针通过留置针的软管插入到血管中，使其前端的三维网络材料暴露在血管里的血液中，后端用肝素帽密封。(3)含有肿瘤细胞的血液会多次流过三维网络生物探针，从而血液中的循环肿瘤细胞被特异性识别和捕获肿瘤细胞的生物分子捕获。所述的三维网络生物探针插入到血管中捕获循环肿瘤细胞后，采用激光照射探针插入活体部位，由于材料表面金纳米管的受激光激发产生光热效应，可原位杀死捕获的肿瘤细胞。本专利技术以三维网络材料为基础，在其表面修饰金纳米管，在金纳米管表面偶联生物靶向分子，得到生物分子功能化的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种三维网络生物探针载体材料的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：(1)将泡沫金属浸入到液态高分子材料中，离心使高分子材料充分填充泡沫金属的空隙；再次离心，除去泡沫金属空隙中多余的高分子材料；将表面包裹高分子材料的泡沫金属加热固化；浸入到酸性溶液中除去泡沫金属，用水漂洗，烘干，得到三维网络材料；(2)将三维网络材料用O2plasma处理后浸入到多巴胺的Tris‑HCl溶液中进行反应，反应结束后取出材料用水漂洗，得到聚多巴胺修饰的三维网络材料；(3)将聚多巴胺修饰的三维网络材料浸入到银纳米线异丙醇溶液中进行反应，反应结束后取出材料挥发掉其中的异丙醇，得到银纳米线修饰的三维网络材料；(4)将银纳米线修饰的三维网络材料浸入到[Au(en)2]Cl3水溶液中进行金‑银置换反应，反应结束后取出材料用水漂洗、烘干，得到三维网络生物探针载体材料。

【技术特征摘要】
1.一种三维网络生物探针载体材料的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：(1)将泡沫金属浸入到液态高分子材料中，离心使高分子材料充分填充泡沫金属的空隙；再次离心，除去泡沫金属空隙中多余的高分子材料；将表面包裹高分子材料的泡沫金属加热固化；浸入到酸性溶液中除去泡沫金属，用水漂洗，烘干，得到三维网络材料；(2)将三维网络材料用O2plasma处理后浸入到多巴胺的Tris-HCl溶液中进行反应，反应结束后取出材料用水漂洗，得到聚多巴胺修饰的三维网络材料；(3)将聚多巴胺修饰的三维网络材料浸入到银纳米线异丙醇溶液中进行反应，反应结束后取出材料挥发掉其中的异丙醇，得到银纳米线修饰的三维网络材料；(4)将银纳米线修饰的三维网络材料浸入到[Au(en)2]Cl3水溶液中进行金-银置换反应，反应结束后取出材料用水漂洗、烘干，得到三维网络生物探针载体材料。2.一种三维网络生物探针载体材料，其特征在于：通过权利要求1所述的制备方法得到。3.一种三维网络生物探针材料的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：(1)将权利要求2所述的三维网络生物探针载体材料浸入到巯基乙酸溶液中避光反应，反应结束后取出材料，用PBS漂洗；(2)将步骤(1)得到的材料用化学交联剂活化后，浸入到生物分子溶液中进行孵育，再经PBS充分洗涤后得到生物分子功能化修饰的三维网络生物探针材料。4.一种三维网络生物探针材料，其特征在于：通过权利要求3所述的制备方法得到。5.一种用于活体的三维网络生物探针的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：将权利要求4所述的三维网络生物探针材料裁剪成1-5mm宽、1-10mm...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄卫华，程世博，谢敏，陈苗苗，
申请(专利权)人：武汉大学，
类型：发明
国别省市：湖北,42