本发明专利技术公开了一种岷江百合Lr4CL‑1基因及应用，所述Lr4CL‑1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，本发明专利技术将含有Lr4CL‑1基因的过表达载体转入烟草中，获得的转基因烟草植株对灰葡萄孢、链格孢和炭疽病菌等病原菌具有明显抑制作用，同时发现转基因植株叶片更加深绿且轻微下垂。本发明专利技术通过功能基因组学研究证明Lr4CL‑1基因具有提高植物抗真菌以及改变叶片性状的双重功能，为今后利用该基因进行植物分子遗传改良提供理论和技术支持，因此具有潜在的应用价值。
A Lr4CL-1 Gene from Lilium Minjiang and Its Application
The invention discloses a Lr4CL_1 gene of Lilium Minjiang and its application. The nucleotide sequence of the Lr4CL_1 gene is as SEQ ID NO.1, and the amino acid sequence encoded by the Lr4CL_1 gene is as SEQ ID NO.2. The overexpression vector containing the Lr4CL_1 gene is transferred into tobacco, and the obtained transgenic tobacco plant has obvious inhibition effect on pathogenic bacteria such as Staphylococcus cinerea, Alternaria spp. and Anthrax fungus. At the same time, it was found that the leaves of transgenic plants were darker green and slightly drooping. The Lr4CL 1 gene has the dual functions of improving plant antifungal activity and changing leaf traits through functional genomics research, and provides theoretical and technical support for future plant molecular genetic improvement using the Lr4CL 1 gene, so it has potential application value.
【技术实现步骤摘要】
一种岷江百合Lr4CL-1基因及其应用
本专利技术属于植物基因工程
，特别的涉及一种岷江百合Lr4CL-1基因及其应用。
技术介绍
在农业生产中，植物病害尤其是真菌病害一直是限制农作物产量提高的重要因素。目前主要采用化学农药作为防治病害的主要手段，但长期使用化学农药不仅导致病原菌产生抗药性，同时还造成生态环境的破坏。因此，抗病品种选育越来越受关注，成为植物病害的有效防治措施之一。然而，由于常规育种周期长、育种资源有限、病原菌变异迅速，因此不易获得抗性植株，难以满足生产的需要。随着生物工程技术发展，研究者开始利用转基因技术，将外源抗病基因转入植物以提高植株的抗病性；这种方法具有选育速度快，易于获得抗性植株，且具有较好的遗传稳定性等优点，已成为获得抗病性植株的主要手段。但目前由于缺乏高效、广谱、持久的抗病基因，植物抗病基因工程在农业生产和商业上的应用受到很大限制；因此，获得高效、广谱的抗病基因，并分析其对植物抗病能力的影响是植物抗病基因工程的研究重点。岷江百合(LiliumregaleWilson)是百合科百合属中重要的野生种质资源，广泛分布于我国四川岷江流域(杨利平和符勇耀著，中国百合资源利用研究[M]，哈尔滨：东北林业大学出版社,2018.11)。相对于模式植物，岷江百合的生长发育调控机制具有复杂性和特殊性。前人研究表明，岷江百合对百合真菌病和病毒病具有较强的抗性，目前已经从岷江百合中获得多个逆境胁迫相关基因，如Lr14-3-3、LrPR10、LrbZIP1和LrWRKY1等(LiH.,etal.,Sci.Hort.2014,168:9-16；HeH.,etal.,GenesGenom.2014,36:497-507；ZhangN.N.,GenesGenom.etal.,2014,36:789-798；HanQ.,etal.,Sci.Hort.2016,198:370-378；专利号201610001896.4)，为了丰富基因库这些抗性基因还远远不够，值得进一步的深入探究岷江百合中更多新的高效抗菌基因。4-香豆酸辅酶A连接酶(4CL,4-coumarate:CoAligase)是连接苯丙烷代谢途径与木质素生物合成途径的关键酶。4CL不仅是木质素合成途径上的限速酶(Weietal.,2013)，而且催化产物香豆酰辅酶A是类黄酮代谢途径上的查耳酮合酶的代谢底物(Cukovicaetal.,2001)；Mansell等(1976)首次从嫩柳枝中提取出4CL以来，4CL基因陆续被克隆出来。目前，4CL已在拟南芥、毛白杨、烟草、大豆、棉花、芒果等植物中得到了克隆。4CL在植物中多以基因家族的形式存在，功能也不相同，Dc4CL1和其他植物中的4CL如拟南芥中的At4CL1(At1g51680)、At4CL2(At3g21240)和大豆的Gm4CL1(AF279267)、Gm4CL2(AF002259)一样参与植物木质素的合成；另一部分如拟南芥中的At4CL3(At1g65060)、大豆中的Gm4CL3(AF002258)和Gm4CL4(X69955)等参与黄酮类化合物的生物合成(Ehltingetal.,1999)。但有关岷江百合4CL基因的研究未见报道，其生物学功能及作用机制存在空白。
技术实现思路
针对现有技术存在的不足，本专利技术的目的在于提供一种岷江百合Lr4CL-1基因，为植物的基因改造提供了一个新的高效抗病基因，为植物抗病基因工程提供了更多的选择，同时也为通过分子手段改良植物抵抗真菌病害能力及叶片性状改变奠定基础。为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：一种岷江百合Lr4CL-1基因，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。上述岷江百合Lr4CL-1基因编码的蛋白，其氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。一种重组载体，包括上述Lr4CL-1基因的核苷酸序列。一种遗传工程化的宿主细胞，含有所述重组载体或基因组中整合所述Lr4CL-1基因。上述Lr4CL-1基因编码的蛋白在对植物病原真菌的抑菌方面的应用。进一步，所述病原真菌为灰葡萄孢、链格孢或炭疽病菌。一种增强植物抗真菌性的方法，包括以下步骤：将制备的或提供的含有所述的Lr4CL-1基因的表达载体转化农杆菌，得到农杆菌工程菌，再将所述农杆菌工程菌浸染植物，使Lr4CL-1基因过表达，即得到转基因植物，与不含有所述Lr4CL-1基因的对照植物相比，所述转基因植物显示增强的抗真菌性能。进一步，所述转基因植物的叶片性状发生改变。进一步，所述叶片性状改变包括：促进叶片叶绿素增多、促进花色素苷增多和/或促进叶片下垂。相比现有技术，本专利技术具有如下有益效果：1、本专利技术首次克隆了岷江百合Lr4CL-1基因全长序列，获得其编码的蛋白序列，并将该蛋白在烟草中表达后，通过抑菌实验，研究该蛋白的抑菌能力，实验结果表明该蛋白对植物病原真菌具有高效广谱抑菌，尤其针对灰葡萄孢(Botrytiscinerea)、链格孢(Alternariaalternate)和炭疽病菌(Colletotrichumliliacearum)具有明显的抑制作用，为植物抗病基因工程提供了一个高效的抗病基因，并为进一步培育具有真菌抗性和叶片性状改变的转基因新材料或新品种奠定了基础。2、本专利技术通过功能基因组学研究证明Lr4CL-1基因具有提高植物抗真菌以及改变叶片性状的双重功能，提供一种改良植物真菌病抗性和改变叶片性状的新方法。该方法通过分子手段定向培育转基因植物，具有育种周期短，操作简单，容易获得目标材料等优点。利用该方法可获得如观赏花卉，农作物，林木等新材料，可以减少农药使用，降低环境污染，还可以使得植株叶片颜色和形态改变，更加美观。本专利技术为今后利用该基因进行植物分子遗传改良提供理论和技术支持，因此，具有重要的推广价值。附图说明图1为岷江百合Lr4CL-1基因的PCR扩增电泳图；图2为植物过表达载体pART-CAM-Lr4CL-1的图谱示意图；图3为转基因烟草基因组DNA的PCR检测结果电泳图，泳道1-15为T0代转基因株系，M为DL2000，WT为阴性对照，CK为空白对照，P为阳性对照；图4为T1代阳性转基因烟草中Lr4CL-1基因转录水平的定量表达分析柱状图；WT为野生型烟草，OX-L1、OX-L3、OX-L4和OX-L5分别为转基因烟草阳性株系；图5为T1代阳性转基因烟草与野生型烟草的表型图；A图为野生型烟草植株，B图为转基因烟草植株；图6为转基因烟草的叶绿素和花色素苷的含量测定结果图；图A为叶绿素含量的测定结果，图B为花色素苷的测定结果，数据分析采用t-test，星号(**)代表显著性差异水平(P<0.01)；图7为转基因烟草体外抑菌活性效果图；其中A组、B组、C组培养基分别接种灰葡萄孢、链格孢和炭疽病菌；每组培养基从左往右依次添加野生型烟草(WT)叶片提取液，转基因烟草阳性株系OX-L1叶片提取液，转基因烟草阳性株系OX-L3叶片提取液和转基因烟草阳性株系OX-L4叶片提取液。具体实施方式下面结合具体实施例和附图对本专利技术作进一步详细说明，但本专利技术保护范围不局限于所述内容。实施例中所述原料如无特殊说明，均为普通市售产品。实施例中所述的实验方法无特别说明，即按常规分子生物学实验方法操作。实施本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种岷江百合Lr4CL‑1基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
【技术特征摘要】
1.一种岷江百合Lr4CL-1基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。2.如权利要求1所述岷江百合Lr4CL-1基因编码的蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。3.一种重组载体，其特征在于，包括权利要求1所述Lr4CL-1基因的核苷酸序列。4.一种遗传工程化的宿主细胞，其特征在于，含有权利要求3所述重组载体或基因组中整合有权利要求1所述Lr4CL-1基因。5.如权利要求2所述Lr4CL-1基因编码的蛋白在对植物病原真菌的抑菌方面的应用。6.根据权利要求5所述应用，其特征在于，所述病原真菌为灰葡萄孢、链格孢或炭...
【专利技术属性】
技术研发人员：符勇耀，杨利平，杨韦，朱艺勇，郭雅萌，
申请(专利权)人：长江师范学院，
类型：发明
国别省市：重庆,50
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