一种提高钝顶螺旋藻β-胡萝卜素和玉米黄质积累的方法技术

本发明专利技术涉及一种提高钝顶螺旋藻β‑胡萝卜素和玉米黄质积累的方法，具体的说是一种通过在培养基添加氮掺杂碳点，氮源减量，采用合适的接种密度，光照、温度、pH条件培养螺旋藻，使其β‑胡萝卜素和玉米黄质积累。与全程采用基础培养基培养相比，本发明专利技术在β‑胡萝卜素和玉米黄质积累阶段采用氮掺杂碳点氮源减量基础培养基使玉米黄质增加了29～92％，β‑胡萝卜素增加了45～97％。

A Method for Increasing the Accumulation of Beta-Carotene and Zeaxanthin in Spirulina platensis

The invention relates to a method for increasing the accumulation of beta carotene and zeaxanthin in Spirulina platensis, in particular to a method for accumulating beta carotene and zeaxanthin in Spirulina platensis by adding nitrogen-doped carbon dots in the culture medium, reducing the amount of nitrogen source, adopting suitable inoculation density, light, temperature and pH conditions. Compared with the whole process of basic medium culture, the method adopts nitrogen-doped carbon-point nitrogen source reduction basic medium to increase zeaxanthin by 29-92% and beta-carotene by 45-97% in the accumulation stage of beta-carotene and zeaxanthin.

【技术实现步骤摘要】
一种提高钝顶螺旋藻β-胡萝卜素和玉米黄质积累的方法
：本专利技术属于螺旋藻发酵
，涉及一种提高钝顶螺旋藻β-胡萝卜素和玉米黄质积累的方法，具体的说是一种通过在培养基添加氮掺杂碳点，采用合适的接种密度，光照、温度、pH及胁迫条件培养螺旋藻，使其β-胡萝卜素和玉米黄质积累。
技术介绍
：钝顶螺旋藻(Spirulinaplatensis)是一种营养成分丰富的微型蓝藻，富含蛋白质、多糖、不饱和脂肪酸、类胡萝卜素(β-胡萝卜素和玉米黄质)等，特别是β-胡萝卜素的含量是胡萝卜中β-胡萝卜素含量的15倍。螺旋藻光合效率高、生长繁殖快、对环境适应性强且易采收，是目前工业化规模培养的主要微藻之一。螺旋藻被认为是21世纪最理想的保健品，目前国内外已将螺旋藻广泛应用于食品、保健品、化妆品、医药、饲料等行业。类胡萝卜素在自然界广泛存在，在人体中发现的类胡萝卜素主要包括α-胡萝卜素、β-胡萝卜素、叶黄素、玉米黄质、隐黄质和番茄红素。其中β-胡萝卜素等是VA的前体，是人体内维生素A的主要来源。玉米黄质是一种含氧的天然类胡萝卜素，它与叶黄素属于同分异构体，在自然界中分布广泛，大部分存在于自然界中的玉米黄质为全反式异构体。人体内不能合成玉米黄质，需要通过日常饮食获得。大量研究表明：玉米黄质具有抗氧化、预防黄斑衰退、治疗白内障、预防心血管疾病、增强机体免疫力、减缓动脉粥样硬化等健康功效，和人类健康密切相关。
技术实现思路
：本专利技术旨在提供一种同时提高钝顶螺旋藻中β-胡萝卜素和玉米黄质积累的方法。为了实现上述目的，本专利技术采用的技术方案为：将培养至指数生长期的螺旋藻细胞转入添加氮掺杂碳点的培养基，专利技术人通过对螺旋藻生长条件的优化，采用合适的接种密度、光照、温度及胁迫条件培养螺旋藻，使其β-胡萝卜素和玉米黄质积累量得以提高。进一步地，培养基中氮掺杂碳点的添加浓度为5～40mg/L；更进一步地，培养基中氮源浓度为1.25-2.5g/L；具体地，操作步骤如下：1)藻种的培养钝顶螺旋藻细胞在基础培养基中培养，初始接种密度OD560为0.2，培养温度28℃，光照强度为3000Lux，培养至指数生长期；基础培养基组成如下：碳酸氢钠13.6～16.8g/L，碳酸钠2.4～4.03g/L，磷酸氢二钾0.5-1.0g/L，硝酸钠2.5-5.0g/L，硫酸钾1.0g/L，氯化钠1.0g/L，七水和硫酸镁0.2g/L，二水和氯化钙0.04g/L，七水合硫酸亚铁0.01～0.20g/L，A5组分1mL/L，其余为水，pH值8～10，；其中A5组分配方如下：硼酸2.86g/L，四水氯化锰1.86g/L，七水硫酸锌0.22g/L，二水钼酸钠0.39g/L，五水硫酸铜0.08g/L，四水硝酸钴0.05g/L，其余为水；2)钝顶螺旋藻细胞β-胡萝卜素和玉米黄质的积累将培养至指数生长期的螺旋藻细胞作为藻种，将藻种液经离心或过滤洗涤后得到藻泥，接入新鲜添加氮掺杂碳点氮源减量基础培养基，并调整初始接种密度至OD560为0.2～0.4；温度26～30℃，pH值8～10，人工光暗比12h：12h光照，培养液受光面光照强度1500～4500Lux，培养9～12天至稳定期收获藻细胞；所述氮掺杂碳点氮源减量基础培养基是在基础培养基中添加10～40mg/L的氮掺杂碳点，并将硝酸钠含量调整为1.25-2.5g/L；在本专利技术的一种实施方式中，藻种液经新鲜添加氮掺杂碳点氮源减量基础培养基直接稀释至初始接种密度OD560为0.2～0.4；所述氮掺杂碳点(以下简称N@CDs)采用水溶性牛血清白蛋白(BSA)水热法的合成，包括如下步骤：将牛血清白蛋白在超纯水中按1.0-1.5:100-200(m:V)溶解后，于180-200℃加热6-8h进行碳化，反应结束后降至室温，高速离心去除碳化物炉渣，将获得的包含N@CDs淡黄色液体通过微滤膜进行过滤去除大颗粒，并用500Da的透析膜透析，最终进行冻干备用；进一步地，N@CDs的制备方法如下：将0.1gBSA(66.5kD)放入20mL超纯水中，在室温的条件下超声溶解15min来制备BSA水溶性均质液；而后将水溶液转移至25ml的内衬为聚四氟乙烯的不锈钢高压釜中，并在干燥热风烤箱中195℃加热6h来促进BSA的碳化；反应结束后，降温至室温；通过离心(10000rpm，15min)的方法去除最终产品溶液中的碳化物炉渣；将最终得到的包含N@CDs淡黄色液体通过0.2微米滤膜进行过滤去除大颗粒，并用500Da的透析膜透析24h，最终进行冻干备用。3)培养至稳定期收获藻细胞后，提取β-胡萝卜素和玉米黄质。玉米黄质产量达到0.28-0.43mg/g(藻体干重)，β-胡萝卜素产量达到0.88-1.20mg/g(藻体干重)。与全程采用基础培养基培养相比，本专利技术在β-胡萝卜素和玉米黄质积累阶段采用氮掺杂碳点氮源减量基础培养基使玉米黄质增加了29～92％，β-胡萝卜素增加了45～97％。有益效果：1、本专利技术实现了钝顶螺旋藻中β-胡萝卜素和玉米黄质产量的提高：依此方法培养钝顶螺旋藻，其β-胡萝卜素产量提高了45～97％，玉米黄质产量提高29～92％。2、培养成本低，β-胡萝卜素与玉米黄质积累迅速：利用添加氮掺杂碳点到基础培养基培养螺旋藻，可以提高单位培养基投入的产品产出，有利于降低生产成本；β-胡萝卜素与玉米黄质在藻细胞内短时间内积累，一般9-12天可以达到最大产量，生产周期短。总之，本专利技术解决了螺旋藻β-胡萝卜素与玉米黄质不能积累的矛盾，实现了快速高效地生产螺旋藻中的β-胡萝卜素与玉米黄质，具有营养盐消耗少、生产成本低、β-胡萝卜素与玉米黄质含量高等优点，有利于简化下游加工操作，促可广泛应用于以螺旋藻为原料的食品、医药、能源等相关领域。附图说明：图1添加氮掺杂碳点(N@CDs)及牛血清白蛋白对钝顶螺旋藻生长的影响；图2不同氮掺杂碳点(N@CDs)添加浓度对钝顶螺旋藻玉米黄质及β-胡萝卜素积累量的影响。具体实施方式：为了使本专利的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图和具体实施例，对本专利进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利，并不用于限定本专利技术。本专利技术所采用的产物测定方法如下：1)β-胡萝卜素和玉米黄质提取：藻液过滤，离心得藻泥，进行真空冷冻干燥，加入丙酮，冰浴超声破碎20min，取上清备测。2)定量验证：高效液相色谱法测螺旋藻中β-胡萝卜素和玉米黄质含量，流动相V甲醇：V丙酮＝95:5。实施例中所采用的螺旋藻均为钝顶螺旋藻(Spirulinaplatensis)FACHB-904，购买自中科院淡水藻种库。以上选用的菌种应理解为示例性的而非具体限定，本专利技术方法对于目前已知的同种属的菌株均适用。下面将通过具体实施例对本专利技术做进一步的解释说明。实施例1添加氮掺杂碳点(N@CDs)对钝顶螺旋藻生长的影响操作步骤如下：1)钝顶螺旋藻细胞在基础培养基中培养，培养基用去离子水配制，初始接种密度OD560为0.2，pH值8，培养温度28℃，光照强度3000Lux，培养时间9～10天至对数生长期。2)将步骤1)中培养至OD560为1.0左右的螺旋藻培养液以10～15％的接种量分别接种于：①添加氮掺杂碳点N@CDs(20mg/L)的基础培养基；本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种提高钝顶螺旋藻β‑胡萝卜素和玉米黄质的方法，其特征在于，将培养至指数生长期的螺旋藻细胞转入添加氮掺杂碳点的培养基中，调整初始接种密度至OD560为0.2～0.4；温度26～30℃，pH值8～10，培养液受光面光照强度1500～4500Lux，培养至稳定期收获藻细胞。

【技术特征摘要】
1.一种提高钝顶螺旋藻β-胡萝卜素和玉米黄质的方法，其特征在于，将培养至指数生长期的螺旋藻细胞转入添加氮掺杂碳点的培养基中，调整初始接种密度至OD560为0.2～0.4；温度26～30℃，pH值8～10，培养液受光面光照强度1500～4500Lux，培养至稳定期收获藻细胞。2.如权利要求1所述的一种提高钝顶螺旋藻β-胡萝卜素和玉米黄质的方法，其特征在于，培养基中氮掺杂碳点的添加浓度为5～40mg/L。3.如权利要求1所述的一种提高钝顶螺旋藻β-胡萝卜素和玉米黄质的方法，其特征在于，培养基中氮源的浓度为1.25-2.5g/L。4.如权利要求1-3任意一项所述的一种提高钝顶螺旋藻β-胡萝卜素和玉米黄质的方法，其特征在于，步骤如下：1)藻种的培养钝顶螺旋藻细胞在基础培养基中培养至指数生长期；2)钝顶螺旋藻细胞β-胡萝卜素和玉米黄质的积累将培养至指数生长期的螺旋藻细胞作为藻种，将藻种液经离心或过滤洗涤后得到藻泥，接入新鲜添加氮掺杂碳点氮源减量的基础培养基中，并调整初始接种密度至OD560为0.2～0.4；温度26～30℃，pH值8～10，人工光暗比12h：12h光照，培养液受光面光照强度1500～4500Lux，培养9～12天至稳定期收获藻细胞；3)培养至稳定期收获藻细胞后，提取β-胡萝卜素和玉米黄质；所述氮掺杂碳点的添加浓度为5～40mg/L；所述氮源的浓度为1.25-2.5g/L。5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，基础培养基组成如下：碳酸氢钠13.6～16.8g/L，碳酸钠2.4～4.03g/L，磷酸氢二钾0.5-1.0g/L，硝酸钠2.5-5.0g/L，硫酸钾1.0g/L，氯...

【专利技术属性】
技术研发人员：任迪峰，安君，冯艳霞，
申请(专利权)人：北京林业大学，
类型：发明
国别省市：北京,11