一种空间转录组检测芯片及方法技术

本发明专利技术提供了一种空间转录组测序芯片及方法,该芯片及方法用于测定组织内不同空间位置中的一种或多种单细胞序列；包括微孔板以及编码测序微球，微孔板上设有编码测序微球；所述方法包括使用多种随机编码与微球偶联,其中每一种随机编码包括分子标记和位置标记条形码；分子标记可以检测组织单细胞的序列信息，位置标记用来记录组织的单细胞空间位置信息；基于该检测芯片及方法可以分析检测组织单细胞特异性转录组信息,并且可同时检测出上述组织中成千上万单细胞的空间位置。

A chip and method for detecting spatial transcriptome

The present invention provides a spatial transcriptome sequencing chip and method for determining one or more single cell sequences in different spatial locations of tissues, including a microporous plate and a coded sequencing microsphere with coded sequencing microspheres on the microporous plate. The method includes coupling microspheres with multiple random codes, each of which includes molecular markers and bits. Label bar code; Molecular marker can detect the sequence information of single cell in tissue, and location marker can record the spatial location information of single cell in tissue; Based on this detection chip and method, we can analyze and detect the specific transcriptome information of single cell in tissue, and simultaneously detect the spatial location of tens of thousands of single cells in the above tissue.

【技术实现步骤摘要】
一种空间转录组检测芯片及方法
本专利技术涉及生物
，特别是涉及一种空间转录组测序芯片及方法。
技术介绍
传统的转录组研究，在大多数情况下都是针对混合的大量细胞进行的，无法观察到单个细胞之间细微的差别，掩盖了独立个体样本的行为以及生命现象中特异性和细胞差异性。而针对单个细胞的研究，是细胞生命分析技术所追求的极限状态，是对传统技术发展的终极挑战。多细胞团如组织和肿瘤可以包括异质细胞环境。这些复杂的细胞环境通常可以展示出多种表型，这些表型可以指示多种基因型。从多细胞复杂性中提炼到单细胞可变性是理解多细胞异质性的重要方面。目前，组织转录组通常通过均质活检的RNA测序进行研究，导致了组织细胞空间信息的缺失。或者存在一些方法来进行细胞位置定位监测，但它们在可分析的转录本数量有限，并依赖于大量的现有数据集、昂贵仪器或大量工作量。但是，确定样品中靶分子的身份和位置对于临床应用、诊断学以及生物医学研究是重要的。因此，存在对能够使靶分子在样品内的位置相关联的方法和技术的需求。
技术实现思路
为了满足上述需求，本文提供了一种空间转录组测序芯片及方法，该芯片及方法用于测定组织内单细胞的序列信息及空间位置信息。本文采用的技术方案是：一种空间转录组的检测芯片，包括微孔板以及编码测序微球，微孔板上设有编码测序微球；所述方法通过标记随机编码测序微球的空间条形码信息来记录组织单细胞的空间位置信息。优选的，所述编码测序微球为微球本体与寡核苷酸链进行偶联反应生成，寡核苷酸链作为空间标记和分子标记进行偶联反应。优选的，所述寡核苷酸链为微球本体与多聚U尾进行偶联反应生成，作为扩增引物结合区域的扩增及测序序列，提供细胞空间位置信息的空间条形码，进行原位杂交的原位测序序列，防止扩增引起的偏差同时记录表达量的UMI，捕获组织细胞中mRNA的反转录寡核苷酸引物多聚T尾。优选的，所述寡核苷酸链包括多聚U尾、扩增及测序引物、位置条形码、原位测序引物、UMI和多聚T尾。优选的，所述微孔板的制备方法，具体步骤如下：（1）在硅片上蚀刻微孔作为初始模具，微孔直径在10~200μm;（2）在初始模具上浇注聚二甲基硅氧烷，成型后取下，即可制成带有微柱的反向模具；（3）在反向模具上浇注加热融化的琼脂糖，冷却成型后取下，即可制成微孔板。优选的，所述微孔板上设有微孔，所述编码测序微球投入至微孔内；所述微孔为圆形、六边形、方形或其他孔型；优选的，所述微孔的排列方式为四方排列、六方排列、其他有规则排列或者无规则排列。优选的，所述微孔的间距为1-100μm。优选的，所述微孔的数目为1个及以上。优选的，所述微球本体的直径为10-35μm。优选的，所述微球本体为硅胶微球、玻璃微球、磁性微球、交联葡聚糖琼脂糖凝胶微球、二氧化硅微球、纤维素微球、聚苯乙烯微球或聚丙烯微球中任意一种或以上的组合。优选的，一种空间转录组的检测芯片的检测方法，所述具体步骤为：（1）编码测序微球的制备：将编码测序微球加入到微孔板中，编码测序微球加入微孔板中的落孔率大于99%；对微孔板中的编码测序微球进行测序，并记录编码测序微球在微孔板中编号，或将已知编码序列的编码测序微球按照序列加入微孔中，并记录微球在微孔板中的位置信息；其中微孔板微孔直径大小为刚好容纳一个编码测序微球；（2）组织切片，组织来自不同器官；（3）组织固定；（4）渗透处理；（5）cDNA合成：将组织盖印在装有放置编码序列微球的微孔板芯片上，捕获组织细胞中mRNA，进行反转录，合成cDNA；其中微孔板的微孔直径大小为刚好容纳一个单细胞；单细胞加入微孔的落孔率控制在40%以上；（6）组织移除；（7）微球释放；（8）测序文库建设、测序、数据处理及分析：收集带有编码测序微球的单细胞，构建测序文库，进行组织细胞序列及空间位置信息检测。优选的，所述编码测序微球中的每个空间条形码阵序列均不同。由于采用了以上技术，本专利技术较现有技术相比，具有的有益效果如下：分析组织切片中的信使RNA是生物医学研究和诊断的基石。本专利技术允许在单个组织切片上对具有空间分辨率的转录体进行可视化和定量分析。通过在具有独特位置条形码的阵列反转录引物上定位组织学切片，在展示高质量的RNA测序数据的同时并保留了来自小鼠大脑的空间位置信息。本专利技术构建了一个微孔阵列芯片，实现原位检测组织细胞序列和位置信息，可实现生物组织的简单、无损伤、高分辨率的一种空间转录组检测。附图说明图1是编码测序微球的示意图；图2是编码测序微球随机加入微孔板的示意图；图3是高通量空间转录组检测的示意图；图中：1、微球本体，2、编码测序微球，3、微孔板，4、微孔间距，5、组织。具体实施方式接下来结合一些具体实施案例对本专利技术作进一步阐述，但本专利技术的权利要求不仅仅局限于下述实例。实施例11、微孔板的制备根据实验规模设计微孔板3大小，孔板大小为3mm×3mm，并在硅片上蚀刻出微孔作为初始模具，微孔深度20μm，和微孔直径大小15μm，孔间距4为10μm。硅片上浇注聚二甲基硅氧烷(PDMS)，成型后拿下PDMS，即可制成带有微柱的反向模具，用浓度为5%的用无酶水配制的琼脂糖，热融后浇注在反向模具（PDMS微柱板）上冷凝成型，琼脂糖板揭下来后就是具有一定厚度的微孔板3。保存时在微孔板3表面加上对细胞无害的DPBS-EDTA混合液，加盖保存在4℃冰箱中，即可制得微孔板3，即做即用能保证微孔板3良好的工作状态。2、编码测序微球的制备空间条形码阵列：将1000个寡核苷酸阵列偶联在微球本体1上，其中，每个阵列包括一个18-聚体独特条形码，一个9-聚半随机分子识别码和一个聚-20TVN捕获寡核苷酸；并将编码测序微球2随机固定于微孔板3中的每个微孔中。空间条形码序列：UUUUUGACTCCGTAATACGACTCACTATAGGGACACGACGCTCTTCCGATCT[18mer_SPATIALBARCODE]WSNNWSNNVTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN其中，V是除了T以外的任何核苷酸（A/C/G），N是任何核苷酸（A/T/C/G）。3、组织分离与制备(1)组织切片：取成年小鼠脑组织并速冻。组织在切片前用冷的OCT包埋，然后在低温保持器中进行冷冻切片，厚度为10μm。(2)组织固定：切片组织装在空间条形码阵列修饰的微球本体1所在的微孔板3上，保证每个微孔均有组织5落于上方。4、渗透处理与cDNA合成(1)在微孔中均匀加入70μl内含0.19μg/μlBSA的核酸外切酶I缓冲液，并37℃培育30min；(2)用100μl0.1x的SSC以及二次超纯水清洗微孔板3中的每个微孔；(3)在每个微孔中均匀加入70μl溶于0.1M的HCL中的0.1%的胃蛋白酶(Sigma-Aldrich)，并37℃培育10min；(4)根据步骤(2)重复清洗微孔板3；(5)在（4）中清洗后的微孔板3中每个微孔加入70μl反转录混合液并培育6h。其中，反转录混合液包括：1x第一链缓冲液,5mMDTT,500μMdNTP,0.19μg/μlBSA,50ng/μlActinomycinD,1%DMSO,20U/μlSuperscriptⅢ以及2U/μlRNaseOUT。5、组织移除在每个微孔中加入70μl体积比为1：7的蛋白酶K和PKD缓冲溶液(pH7本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种空间转录组的检测芯片, 其特征在于：包括微孔板以及编码测序微球，微孔板上设有编码测序微球。

【技术特征摘要】
1.一种空间转录组的检测芯片,其特征在于：包括微孔板以及编码测序微球，微孔板上设有编码测序微球。2.如权利要求1所述的一种空间转录组的检测芯片，其特征在于：所述编码测序微球为微球本体与寡核苷酸链进行偶联反应生成。3.如权利要求2所述的一种空间转录组的检测芯片，其特征在于：所述寡核苷酸链为微球本体与多聚U尾进行偶联反应生成。4.如权利要求1所述的一种空间转录组的检测芯片，其特征在于，所述微孔板的制备方法，具体步骤如下：（1）在硅片上蚀刻微孔作为初始模具，微孔直径在10~200μm;（2）在初始模具上浇注聚二甲基硅氧烷，成型后取下，即可制成带有微柱的反向模具；（3）在反向模具上浇注加热融化的琼脂糖，冷却成型后取下，即可制成微孔板。5.如权利要求1所述的一种空间转录组的检测芯片，其特征在于：所述微孔板上设有微孔，编码测序微球投入至微孔内；所述微孔为圆形、六边形或者方形，所述微孔的排列方式为有规则排列或者无规则排列。6.如权利要求5所述的一种空间转录组的检测芯片，其特征在于：所述微孔的间距为1-100μm。7.如权利要求5所述的一种空间转录组的检测芯片，其...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵祥伟，郭云霞，涂景，葛芹玉，
申请(专利权)人：东南大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32