一种RGD多肽修饰壳聚糖/羟基磷灰石复合支架及其制备方法技术

本发明专利技术属于复合支架技术领域，公开了一种RGD多肽修饰壳聚糖/羟基磷灰石复合支架及其制备方法，包括：应用原位杂化法制备具有双重孔道的壳聚糖/纳米羟基磷灰石复合多孔材料，将RGD多肽修饰在材料孔道表面；通过支架与MSCs复合培养，评价本支架对于MSCs细胞的短期粘附率，细胞与支架的粘附微观形态的影响；并制作出人工骨生物材料。应用原位杂化法制备具有双重孔道的壳聚糖/纳米羟基磷灰石复合多孔材料，并应用静电自主装法将RGD多肽修饰在材料孔道表面，得到三维多空支架。并通过支架与MSCs复合培养，评价本支架对于MSCs细胞的短期粘附率，细胞与支架的粘附微观形态的影响，制作出人工骨生物材料，满足临床应用。

A RGD polypeptide modified chitosan/hydroxyapatite composite scaffold and its preparation method

The invention belongs to the technical field of composite scaffolds, and discloses a RGD polypeptide modified chitosan/hydroxyapatite composite scaffold and its preparation method, including: preparing chitosan/nano-hydroxyapatite composite porous material with double channels by in-situ hybridization method, modifying RGD polypeptide on the surface of material channels; evaluating the scaffold for MSCs cells by composite culture of scaffolds and MSCs. Short-term adhesion rate, the effect of cell-scaffold adhesion on micro-morphology, and artificial bone biomaterials were made. Chitosan/nano-hydroxyapatite composite porous materials with double channels were prepared by in-situ hybridization method, and RGD polypeptide was modified on the surface of porous materials by electrostatic self-assembly method to obtain three-dimensional multi-hollow scaffolds. The short-term adherence rate of MSCs cells and the micro-morphology of cell-scaffold adherence were evaluated by co-culture of scaffold and MSCs. The artificial bone biomaterials were made to meet the clinical application.

【技术实现步骤摘要】
一种RGD多肽修饰壳聚糖/羟基磷灰石复合支架及其制备方法
本专利技术属于复合支架
，尤其涉及一种RGD多肽修饰壳聚糖/羟基磷灰石复合支架及其制备方法。
技术介绍
目前，业内常用的现有技术是这样的：骨缺损是骨科临床上常见的问题，每年全世界多达有220万人因外伤、感染、肿瘤等原因而需要骨移植治疗，而在美国，每年需植骨的病人中大约60％采用自体骨移植，34％采用异体骨移植，仅7％的病人采用其它植骨材料。对于外伤，骨肿瘤等各种骨病所引起的骨不连和骨缺损，通常是应用自体或者是同种异体的骨移植来治疗。这些方法虽然也很有效，但仍经常遇到材料来源不足，供体疾病的传染风险，移植材料的塑性困难等。人工植入物由人工合成制备，可以不受供源限制，又由于它是惰性物质，所以避免免疫排斥，然而人工植入物在功能上无法完全替代生物组织与器官，而且有时也会产生异物反应。因此，至今临床上还没有一个完美的方法可以完全解决受损组织和器官的修复问题。因此一定程度上促成了组织工程疗法的快速发展。组织工程化器官将比供体器官更易于获得，由组织工程再造的组织和器官不但可以同人工替代物一样进行大批量的生产，而且这样的组织和器官同天然的组织和器官具有相同的功能，还可防止免疫排斥的产生，被认为是最有希望彻底解决组织和器官修复难题的途径。自1995年来骨组织工程由Crane等提出后取得了长足的发展，作为组织工程研究的重要领域，骨组织工程研究在多个方面均取得了令人振奋的研究成果，并已在临床得到初步应用，被认为是组织工程中最具有前途和可行性的领域之一。目前最有希望在临床广泛使用的骨组织工程种子细胞是骨髓基质干细胞。它具有来源方便，取材简单，对患者的损伤小等优势。BMSCs具有自我更新的能力并且能够多向分化，这是干细胞的共性。已有大量研究证实无论是在裸鼠等、鼠小动物，还是山羊等大动物的体内，BMSCs作为种子细胞都能够有效的形成组织工程骨并成功修复各个部位的骨缺损而且有研究表明成人BMSCs在适宜的诱导条件下也能够表现成骨细胞的形态和功能，并且在裸鼠体内形成组织工程骨，在目前使用BMSCs也取得了相应的良好的疗效也常见诸报端。目前关于BMSCs的研究总体来讲尚处于探索阶段，而以上的研究首先证实了BMSCs作为种子细胞的可能性，并对其诱导转化条件进行了一些探讨，有必要对BMSCs的细胞生物学进行更为深入的研究，而关键问题在于建立完善的BMSCs临床应用技术，而目前急需的是建立一种标准化模式，包括如何在体外获取BMSCs、按照什么方法诱导分化BMSCs等等。随着近些年骨组织工程的快速发展，支架材料的选择和制备成为了研究的热点，理想的骨组织工程支架材料应满足以下几点：1、生物相容性高：除如无毒、不致畸等满足生物材料的一般要求之外，还要有降解产物对细胞无毒害作用，不引起炎症反应并且利于种子细胞的粘附、增殖，对于细胞的生长和分化有促进作用；2、生物降解性适合：支架材料应具有降解功能，骨组织细胞生长速率应与降解速率相适应；3、具有合适的三维立体多孔结构：支架材料应具有三维立体结构，相应的孔隙率，比表面积高，能够为成骨性细胞的黏附、增殖、生长和功能的发挥提供一个最佳的微环境，同时也能够为新骨组织的形成提供空间和支架；4、可塑性和适合的机械强度：支架材料具有良好的可塑性和适合的机械强度，能够支撑新生组织，并直至新生组织具有适当力学特性；5、良好的支架-细胞界面：材料应提供良好的支架-细胞作用界面，利于细胞粘附。生物陶瓷是一种晶体材料，是由金属离子及非金属离子以离子键结合的。根据生物陶瓷在生理环境中的化学活性可分为四类：惰性生物陶瓷、表面活性生物陶瓷、可吸收生物陶瓷及复合生物陶瓷。硫酸钙陶瓷、碳酸钙陶瓷、磷酸钙陶瓷及其同分异构体都属于可降解生物陶瓷。硫酸钙因无骨诱导作用，脆性大所以应用较少。Cheroff从珊瑚中提取碳酸钙陶瓷并于犬的股骨、胫骨骨缺损模型修复中应用。目前广泛应用的骨替代材料之一是以羟基磷灰石为代表的磷酸钙盐陶瓷，它们的骨传导性能都非常好。因为羟基磷灰石的脆性较大且不易被吸收等这些缺点均限制了其在承重部位的应用。但牟善松等通过研究制备出多孔磷酸三钙陶瓷，并分析了其相关的性能，实验证明，该支架可以应用在骨组织工程中。生物衍生骨是这样的一类生物材料。它是用人或动物的骨组织经过一系列方法处理后，将其细胞成分和抗原性去掉，完全或部分保存原来组织网架结构。在国际上已有生物衍生骨材料的产品应用于临床，如Oswestry骨、Bio-Oss、Kiel骨等，并且在临床上取得了良好的疗效。李彦林等应用猪的肋骨制备成部分脱钙骨、完全脱蛋白骨、部分脱蛋白骨三种材料，而且测定了这三种的衍生骨性能。通过电镜观察表明，有原骨组织的网状孔隙结构系统是这三种材料的共性，但它们又各具特点：完全脱蛋白骨(即煅烧骨)的抗原性是三种里最小的，有良好的成骨效果，能够在临床应用并且取得一定的疗效，但机械强度差，有待改进；部分脱蛋白骨具有弱抗原性，其机械强度尚可，但成骨效果不理想；脱钙骨抗原性是三种里最强的，影响成骨，基本无法单独应用。广泛存在于虾、蟹、昆虫等动物的甲壳中的甲壳质脱乙酰后即为壳聚糖，在天然有机化合物中，其数量在自然界仅次于纤维素。壳聚糖是一种新型天然医用生物材料，无毒、有良好的生物相容性，并且其在体内分解后产物可直接代谢并对人体无害。壳聚糖能引导或促进骨的形成有一定的骨传导性。壳聚糖是无抗原性能够诱导细胞增殖并且可以促进植入体与宿主组织一体化。Klokkevold等研究了壳聚糖对体外成骨细胞分化和骨形成的影响，实验结果表明，壳聚糖可以促进前期骨细胞分化，加速骨形成的作用。脱去乙酰基的链节数占所有链节数的百分比为壳聚糖脱乙酰度。壳聚糖脱乙酰度影响着壳聚糖的溶解性能，而且直接决定其分子链上氨基(NH2)含量的多少，因为当其脱乙酰度为50％时，壳聚糖可以获得最佳的溶解性。根据脱乙酰度不同，壳聚糖的PH值在6.5-7.3之间，在壳聚糖中氨基被质子化后，壳聚糖溶液行为表现为弱的聚阳离子电解质。壳聚糖上的氨基和羟基是具有反应活性的基团，因此可以通过化学改性使之具有新功能，如在壳聚糖分子结构进行醋化以增加其溶解性。壳聚糖还有一种特性就是抑菌，它能够抑制细菌的生长和降低其活性。然而必须指出的是不同壳聚糖的种类，以及分子量，并且浓度等一些条件对其抗菌的效果均有影响。壳聚糖无论何种生物材料其生物相容性是首先必须要评估的。壳聚糖在生物体内是如何降解的目前还有很多争议，但较多的学者认为壳聚糖主要是依靠体内环境中的酶降解，如果在中性的水介质中CS的降解较慢。在体内壳聚糖可以很容易的被溶菌酶等酶类降解，其体内降解最终产物氨基葡萄糖，可以完全被人体吸收无毒。壳聚糖能够对机体细胞产生影响是通过粘附、激活和促进及抑制等来作用的。壳聚糖的细胞粘附作用在文献报道中出现较多，其中对成骨细胞和成纤细胞的粘附作用占主要部分。壳聚糖及其衍生物可以抑制微生物生长、止血、止痛、并且能够促进或抑制成纤维细胞增殖、迁移、生长、激活和趋化巨噬细胞、诱导有序的胶原沉积和纤维排列、有利于新生组织的结构重塑和构建等活性，决定了其在组织工程中有重要应用。壳聚糖能够对机体细胞产生影响是通过粘附、激活和促进及抑制等来作用的。壳聚糖的细胞粘附作用在文献本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种RGD多肽修饰壳聚糖/羟基磷灰石复合支架的制备方法，其特征在于，所述RGD多肽修饰壳聚糖/羟基磷灰石复合支架的制备方法包括：步骤一，应用原位杂化法制备具有双重孔道的壳聚糖/纳米羟基磷灰石复合多孔材料，并应用静电自主装法将RGD多肽修饰在材料孔道表面；步骤二，通过支架与MSCs复合培养，来评价本支架对于MSCs细胞的短期粘附率，细胞与支架的粘附微观形态的影响；并制作出人工骨生物材料。

【技术特征摘要】
1.一种RGD多肽修饰壳聚糖/羟基磷灰石复合支架的制备方法，其特征在于，所述RGD多肽修饰壳聚糖/羟基磷灰石复合支架的制备方法包括：步骤一，应用原位杂化法制备具有双重孔道的壳聚糖/纳米羟基磷灰石复合多孔材料，并应用静电自主装法将RGD多肽修饰在材料孔道表面；步骤二，通过支架与MSCs复合培养，来评价本支架对于MSCs细胞的短期粘附率，细胞与支架的粘附微观形态的影响；并制作出人工骨生物材料。2.如权利要求1所述的RGD多肽修饰壳聚糖/羟基磷灰石复合支架的制备方法，其特征在于，所述RGD多肽修饰壳聚糖/羟基磷灰石复合支架的制备方法包括：第一步，原位杂交法CS/HA支架的制备，将Ca(NO3)2·4H2O和KH2PO4添加到体积比为2％的乙酸溶液中混合然后应用磁力搅拌器搅拌3h直至沉积的钙盐完全溶解，配制成HA前驱体溶液；调整液体pH值至4.0；将CS粉末添加到溶液中，在室温下应用磁力搅拌器搅拌4小时，得到质量比为4％CS溶液；转移到干净的烧杯中，静置24h脱泡，形成CS与HA均匀一致的凝胶棒的前驱体溶液；然后取2mlCS溶液注入模具中先形成一层凝固的CS膜，再将已静置好的壳聚糖与羟基磷灰石前驱体溶液注入模具内表面铸造造模，室温下静置12h后将其浸入5wt％氢氧化钠溶液浸泡，形成水凝胶；将水凝胶棒用去离子水冲洗至pH值在7，置于60℃烘箱中空气干燥8-10h；凝胶棒会逐渐变细变小，当其直径为10mm时停止烘干，放入冷冻干燥机中冷冻干燥，得到棒状支架材料；按照规格为直径10mm，厚度1.5mm制成圆片状多孔支架，高温高压...

【专利技术属性】
技术研发人员：曲志伟，
申请(专利权)人：哈尔滨市第一医院，
类型：发明
国别省市：黑龙江,23