靶向wls基因RNA干扰重组慢病毒载体的构建方法技术

本发明专利技术涉及靶向wls基因RNA干扰重组慢病毒载体的构建、筛选及其用途。本发明专利技术利用RNA干扰技术，针对wls基因，构建了能在相关细胞中表达shRNA的慢病毒真核表达载体，干扰慢病毒是由V#wls‑shRNA重组载体质粒、病毒包装辅助质粒(Helper 1.0、Helper 2.0)三质粒共转染293T细胞培养获得。本发明专利技术靶向wls基因RNA干扰重组慢病毒载体能高效、特异地抑制细胞wls基因表达，可为研究wls对相关细胞的分化及功能、相应组织的生长及发育等的调控作用提供一种有效的工具。发明专利技术还进一步公开了靶向wls基因RNA干扰重组慢病毒载体在研究骨组织生长发育过程中wnt配体来源方面的应用，并为实现wnt信号通路在骨组织再生方面的应用提供了一定的理论基础。

Construction of recombinant lentivirus vector targeting WLS gene RNA interference

The present invention relates to construction, screening and application of recombinant lentivirus vector targeting WLS gene RNA interference. The present invention constructs lentivirus eukaryotic expression vector capable of expressing shRNA in related cells by RNA interference technology. The lentivirus is obtained by co-transfection of recombinant vector vector vector vector V # WLS shRNA and virus packaging auxiliary plasmid (Helper 1.0, Helper 2.0) into 293T cells. The recombinant lentivirus vector targeting WLS gene RNA interference can efficiently and specifically inhibit the expression of WLS gene in cells, and can provide an effective tool for studying the regulation of WLS on the differentiation and function of related cells, the growth and development of corresponding tissues, etc. The invention further discloses the application of recombinant lentiviral vector targeting WLS gene RNA interference in the study of Wnt ligand sources during bone tissue growth and development, and provides a theoretical basis for the application of Wnt signaling pathway in bone tissue regeneration.

【技术实现步骤摘要】
靶向wls基因RNA干扰重组慢病毒载体的构建方法
本专利技术涉及一种靶向wls基因RNA干扰重组慢病毒载体的构建方法与生物应用，属于生物

技术介绍
目前研究wnt通路中至关重要的wnt分泌蛋白的作用的研究主要集中在某种wnt蛋白或b-catenin分子上，然而目前发现哺乳动物中19种wnt配体蛋白的表达谱不尽相同，在其部位发挥的功能也不尽相同而又有所冗余代偿。Wnt通路可通过经典与非经典通路等发挥作用，对b-catenin的靶向敲除等技术并不能完全阻断wnt通路。然而靶向敲除wls基因的优势在于：1.敲除wls可以阻断几乎所有wnt蛋白的分泌，可避免众多wnt蛋白的功能代偿。2.利用wls敲除技术可以研究经典和非经典的wnt信号通路的总体作用。3.敲除wls技术可以研究wnt蛋白的自分泌和旁分泌作用。
技术实现思路
针对现有技术中的缺陷，本专利技术的目的是提供一种靶向wls基因RNA干扰重组慢病毒载体的构建方法；并进一步公开其在研究骨组织wnt配体具体来源，及其对骨发育、骨矿化、骨代谢调控方面的应用。本专利技术是通过以下技术方案实现的：本专利技术提供了一种靶向wls基因RNA干本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种靶向wls基因RNA干扰重组慢病毒载体的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：分别构建V#wls‑shRNA重组载体质粒、病毒包装辅助质粒Helper 1.0和病毒包装辅助质粒Helper 2.0；将所述V#wls‑shRNA重组载体质粒、病毒包装辅助质粒Helper 1.0和病毒包装辅助质粒Helper 2.0共同对293T细胞进行转染，得到所述靶向wls基因RNA干扰重组慢病毒载体。

【技术特征摘要】
1.一种靶向wls基因RNA干扰重组慢病毒载体的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：分别构建V#wls-shRNA重组载体质粒、病毒包装辅助质粒Helper1.0和病毒包装辅助质粒Helper2.0；将所述V#wls-shRNA重组载体质粒、病毒包装辅助质粒Helper1.0和病毒包装辅助质粒Helper2.0共同对293T细胞进行转染，得到所述靶向wls基因RNA干扰重组慢病毒载体。2.如权利要求1所述的靶向wls基因RNA干扰重组慢病毒载体的构建方法，其特征在于，所述构建V#wls-shRNA重组载体质粒的构建方法是在V#shRNA载体的多克隆位点中连接双链DNA片段，元件顺序为U6-MCS-Ubiquitin-Cherry-IRES-puromycin，酶切位点为克隆位点：AgeI、EcoRI。3.如权利要求2所述的靶向wls基因RNA干扰重组慢病毒载体的构建方法，其特征在于，所述的双链DNA片段为以下序列：Wls-RNAi寡核苷酸序列：正义链的序列如SEQIDNO.1所示：CCGGTCCAAGGGAAATTGAAGCAAACTCGAGTTTGCTTCAATTTCCCTTGGATTTTTG，正义链的序列如SEQIDNO.2所示：GATCCAAAAATCCAAGGGAAATTGAAGCAAACTCGAGTTTGCTTCAATTTCC...

【专利技术属性】
技术研发人员：蒋欣泉，杜佳慧，林淑贤，
申请(专利权)人：上海交通大学医学院附属第九人民医院，
类型：发明
国别省市：上海,31