用于酶法制备高浓度肌醇的方法技术

本申请涉及一种通过使用以下制备肌醇的方法：包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的肌醇一磷酸合酶；和/或包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列的肌醇一磷酸磷酸酶。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于酶法制备高浓度肌醇的方法
本公开涉及使用由SEQIDNO：1的氨基酸序列组成的肌醇一磷酸盐合酶和由SEQIDNO：3的氨基酸序列组成的肌醇一磷酸盐磷酸酶制备高浓度肌醇的方法。
技术介绍
肌醇是大多数高等动物的必需成分，广泛用作食品、饲料、化妆品和制药领域的保健功能材料。例如，已知肌醇在胆固醇和脂肪的代谢中具有重要作用，并且据报道其有效预防或治疗高胆固醇血症等。此外，肌醇已被用作化妆品材料，因为它具有皮肤功能例如保湿、控制皮脂、通过调节抗氧化活性抗衰老等。能够使用肌醇作为原料合成的衍生物作为高附加值的功能性材料也引起了人们的注意。例如，据报道它们是作为磷酸聚糖的主要成分用于递送胰岛素信号的重要介质。另外，作为其实例，存在已知有效治疗2型糖尿病的D-手性肌醇和D-松醇，以及预期用作阿尔茨海默病治疗剂(2000.JBiolChem.275：18495-18502)、生理活性物质的合成原料(美国专利号5,412,080)和液晶化合物的合成原料(德国专利号3,405,663)的鲨肌醇。已经报道了在工业规模上开发和改进肌醇生产方法的各种方法。通过使用本领域已知的常规物理化学提取(酸、碱、热、压力等)方法从米糠、玉米浆等中纯化肌醇。已知通过从原料直接提取进行的生产方法不仅具有低产率而且由于难以在纯化过程中调节产率和纯度而具有非常低的生产效率，因为每种原料的提取物中包含大量的各种杂质。作为另一种方法，已经报道了通过新发现具有高肌醇生产能力的菌株或通过遗传修饰合成代谢途径从发酵肉汤中分离和纯化肌醇的发酵生产方法。生产菌株包括酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、念珠菌(Candida)(JPKokai8-00258、JPKokai8-38188、JPKokai8-89262、JPKokai9-117295、JPKokai10-42860、JPKokai10-42882、JPKokai10-42883、JPKokai2000-41689、JPKokai9-220093、JPKokai10-271995)、毕赤酵母(Pichiapastoris)(JPKokai2011-55722)和大肠杆菌(Escherichiacoli)(1999.J.Am.Chem.Soc.121：3799-3800，国际专利号WO2009/145838)等。然而，这种发酵方法具有低生产率，因此尚未实际应用于工业规模生产方法。
技术实现思路
[技术问题]本专利技术人已经进行了大量努力以开发能够生产高浓度肌醇的新型制备方法。因此，他们证实了通过使用本公开的肌醇一磷酸盐合酶和/或肌醇一磷酸盐磷酸酶能够高产率地生产肌醇，从而完成了本公开。[技术方案]本公开的一个目的是提供一种使用由SEQIDNO：1的氨基酸序列组成的肌醇一磷酸盐合酶和由SEQIDNO：3的氨基酸序列组成的肌醇一磷酸盐磷酸酶制备肌醇的方法。[有益效果]本公开的肌醇一磷酸盐磷酸酶由SEQIDNO：3的氨基酸序列组成，允许肌醇一磷酸盐在一段时间内以非常高的产率转化为肌醇(1小时反应为约85％)。另外，根据本公开的方法，肌醇在细胞外酶促反应缓冲液中生产，因此与通过使用重组细胞的发酵方法生产肌醇的情况相比，以低成本生产肌醇。附图说明图1是示意性显示了肌醇的转化途径以及参与其中的酶的图。图2显示了通过使用色谱法从(A)含有SEQIDNO：1的酶的转化体和(B)含有SEQIDNO：3的酶的转化体生产的重组酶。在图中，“M”是指蛋白质大小标记；“CFE”是指无细胞提取物；“PE”是指纯化酶。图3是显示HPLC分析结果的图，其证实了肌醇一磷酸盐合酶的活性。图4是显示HPLC分析结果的图，其证实了肌醇是否通过同时使用肌醇一磷酸盐合酶和肌醇一磷酸盐磷酸酶由葡萄糖-6-磷酸盐产生。具体实施方式在下文中，将详细描述本公开。同时，本文公开的每个解释和示例性实施方式可以应用于其它解释和示例性实施方式。也就是说，本文公开的各种因素的所有组合都属于本公开的范围。此外，本公开的范围不应受下文提供的具体公开的限制。为了实现本公开的目的，本公开的一个方面提供了由SEQIDNO：1的氨基酸序列组成的肌醇一磷酸盐合酶。另外，本公开的另一方面提供了由SEQIDNO：3的氨基酸序列组成的肌醇一磷酸盐磷酸酶。另外，本公开的肌醇一磷酸盐合酶和肌醇一磷酸盐磷酸酶中的每一种可含有与SEQIDNO：1的氨基酸序列具有至少80％、90％、95％、97％或99％同源性的肽。例如，显而易见的是，具有某些序列的缺失、修饰、取代或添加的氨基酸序列的蛋白质也落入本公开的范围内，只要其具有同源性并显示出与由SEQIDNO：1或SEQIDNO：3的氨基酸序列组成的蛋白质相对应的功效即可。另外，只要蛋白质具有与由SEQIDNO：1的氨基酸序列组成的本公开的肌醇一磷酸盐合酶或由SEQIDNO：3的氨基酸序列组成的本公开的肌醇一磷酸盐磷酸酶相对应的功效，它不排除可通过SEQIDNO：1或SEQIDNO：3的氨基酸序列上游或下游添加无意义的序列而发生的突变，天然发生的突变或沉默突变。另外，包含SEQIDNO：1或SEQIDNO：3的氨基酸序列的蛋白质也属于本公开的范围。此外，肌醇一磷酸盐合酶可以由SEQIDNO：2的核苷酸序列编码，或肌醇一磷酸盐磷酸酶可以由SEQIDNO：4的核苷酸序列编码，但是这些不限于此。另外，肌醇一磷酸盐合酶和肌醇一磷酸盐磷酸酶中的每一种可以由与SEQIDNO：2或SEQIDNO：4的核苷酸序列具有至少80％、90％、95％、97％或99％同源性的核苷酸序列编码。基于密码子简并性，由SEQIDNO：1或SEQIDNO：3的氨基酸序列组成的蛋白质，或者可以翻译成与上述蛋白质具有同源性的蛋白质的多核苷酸显然可以包括在本公开的范围内。如本文所用，术语“同源性”是指与给定氨基酸序列或核苷酸序列的匹配程度，并且同源性可以表示为百分比。在本公开中，具有与给定氨基酸序列或核苷酸序列相同或相似的活性的同源序列表示为“％同源性”。同源序列可以通过例如标准软件，特别是BLAST2.0，其计算诸如得分、同一性、相似性等参数，或通过在限定的严格条件下比较Southern杂交实验中的序列来确定，并且限定合适的杂交条件在本领域技术范围内，并且可以通过本领域技术人员熟知的方法确定(例如，J.Sambrook等人，MolecularCloning,ALaboratoryManual，第二次编辑，ColdSpringHarborLaboratorypress，ColdSpringHarbor，NewYork，1989；F.M.Ausubel等人，CurrentProtocolsinMolecularBiology，JohnWiley&Sons,Inc.，NewYork)。如本文所用，术语“严格条件”是指旨在允许多核苷酸之间特异性杂交的条件。例如，这些条件在文献中有具体描述(例如，J.Sambrook等人，同上)。在本公开中，可以调整严格条件以确定同源性。为了证实多核苷酸之间的同源性，可以使用对应于55℃的Tm值的低严格性杂交条件。例如，可以使用含有5XSSC，0.1％SDS，0.25％乳和无甲酰胺的杂交溶液；或者可以使用含有30％甲酰胺，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于制备肌醇的方法，其包括：通过使肌醇一磷酸盐与由SEQ ID NO：3的氨基酸序列组成的肌醇一磷酸盐磷酸酶、表达所述肌醇一磷酸盐磷酸酶的微生物、或所述微生物的培养物反应，从而将肌醇一磷酸盐转化为肌醇。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.06.30 KR 10-2016-00825501.一种用于制备肌醇的方法，其包括：通过使肌醇一磷酸盐与由SEQIDNO：3的氨基酸序列组成的肌醇一磷酸盐磷酸酶、表达所述肌醇一磷酸盐磷酸酶的微生物、或所述微生物的培养物反应，从而将肌醇一磷酸盐转化为肌醇。2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述方法还包括在将所述肌醇一磷酸盐转化为肌醇之前，通过使葡萄糖-6-磷酸盐与由SEQIDNO：1的氨基酸序列组成的肌醇一磷酸盐合酶、表达所述肌醇一磷酸盐合酶的微生物、或所述微生物的培养物反应，从而将葡萄糖-6-磷酸盐转化为肌醇一磷酸盐。3.根据权利要求2所述的方法，其中，所述方法还包括在将所述葡萄糖-6-磷酸盐转化为肌醇一磷酸盐之前，通过使葡萄糖-1-磷酸盐与磷酸葡萄糖变位酶、表达所述磷酸葡萄糖变位酶的微生物、或所述微生物的培养物反应，从而将葡萄糖-1-磷酸盐转化为葡萄糖-6-磷酸盐。4.根据权利要求2所述的方法，其中，所述方法还包括在将所述葡萄糖-6-磷酸盐转化为肌醇一磷酸盐之前，通过使葡萄糖与磷酸盐和葡萄糖激酶、表达所述葡萄糖激酶的微生物、或所述微生物的培养物反应，从而将葡萄糖转化为葡萄糖-6-磷酸盐。5.根据权利要求3所述的方法，其中，所述方法还包括在将所述葡萄...

【专利技术属性】
技术研发人员：梁成才，赵显国，李英美，金成俌，赵成捘，
申请(专利权)人：CJ第一制糖株式会社，
类型：发明
国别省市：韩国,KR