一种防治冠状动脉微栓塞致心肌损伤的药物及动物模型制造技术

本发明专利技术属于防治冠状动脉心肌损伤技术领域，公开了一种防治冠状动脉微栓塞致心肌损伤的药物及动物模型；采用SD大鼠，以42μm微栓子制备冠脉微栓塞CME动物模型；选择CME后3h、6h、9h、12h、24h为观察时间点，在各时间点观察组中分为假手术组、CME组，检测TLR4在各时间点的表达量以及心功能变化，找出TLR4活性的高峰时间；根据TLR4活性高峰时间点，再分为假手术组、CME组、CME+尼可地尔组、CME+TLR4抑制剂组。本发明专利技术确定CME发生后，TLR4介导的细胞信号转导通路“TLR4/MyD88/NF‑κB/TNF‑α”的动态变化；确定尼可地尔是否阻断“TLR4/MyD88/NF‑κB/TNF‑α”信号通路，保护CME所致的心肌损伤。

A Drug and Animal Model for Prevention and Treatment of Myocardial Injury Induced by Coronary Microembolism

The invention belongs to the technical field of prevention and treatment of coronary myocardial injury, and discloses a drug and animal model for prevention and treatment of myocardial injury caused by coronary microembolism; a coronary microembolism CME animal model is prepared by using SD rats with 42 um microembolism; the observation time points are 3 hours, 6 hours, 9 hours, 12 hours and 24 hours after CME, and the observation group is divided into sham operation group and CME group at each time point, and TLR4 is detected in each time point. According to the peak time of TLR4 activity, the patients were divided into sham operation group, CME group, CME + nicorandil group and CME + TLR4 inhibitor group. The present invention determines the dynamic changes of TLR4/MyD88/NF kappa B/TNF_a cell signal transduction pathway mediated by TLR4 after the occurrence of CME, and determines whether nicorandil blockades the TLR4/MyD88/NF_kappa B/TNF_a signal pathway to protect CME-induced myocardial injury.

【技术实现步骤摘要】
一种防治冠状动脉微栓塞致心肌损伤的药物及动物模型
本专利技术属于防治冠状动脉心肌损伤
，尤其涉及一种防治冠状动脉微栓塞致心肌损伤的药物及动物模型。
技术介绍
目前，业内常用的现有技术是这样的：冠状动脉微栓塞(CoronaryMicroembolization，CME)是由冠脉粥样斑块自发破裂或冠脉介入治疗(PercutaneousCoronaryIntervention，PCI)过程中微小栓子造成的冠状动脉微循环栓塞和心肌微梗死，其发生率为15-20％，在高危患者可高达30-45％。研究表明：(1)CME可导致术后即刻“无血流”或“慢血流”，是远期预后不良和主要心脏不良事件发生的强烈预测因子；(2)CME常引起微循环功能障碍，包括心肌出现微梗死灶、心肌灌注收缩功能失调、心肌细胞凋亡和坏死、冠脉储备下降，是导致心功能障碍、心律失常等的重要原因；(3)CME发生后，即使心肌灌注血流恢复正常，亦导致心肌收缩功能显著下降；(4)一旦CME发生，无论冠脉内应用溶栓剂Urokinase、硝酸甘油、钙离子拮抗剂(如异搏定)亦或血小板GPIIb/IIIa受体抑制剂等补救措施均不能显著改善患者近期或远期临床预后；临床研究表明，远端血栓保护装置是目前预防CME较为理想的措施，但其高昂成本、复杂技术及适应征范围限制其广泛应用。因此，CME并发症一直是临床亟待解决的棘手难题并引起广泛关注。关于CME致心肌损伤的机制，既往研究发现CME后冠脉血流短暂减少即可恢复正常，而局部心肌收缩能力却进行性降低。进一步研究显示CME常伴有心肌炎症反应，表现为微梗死灶周围有明显白细胞和单核/巨噬细胞浸润，而CME所致坏死心肌细胞仅占少数，冠脉血流的短暂减少亦相对次要；在应用糖皮质激素干预后，局部炎症反应及炎症因子水平明显减少，心功能亦有所改善，说明CME所致心肌损伤与心外膜冠脉血流量的减少及少量心肌细胞坏死并无明显关系，而与局部炎症反应密切相关。前期的动物实验亦发现，CME所致心肌微梗死灶周围可见大量炎性细胞浸润，并伴炎性因子大量释放，由此引发的心肌局部炎症反应，是导致CME后心肌损伤和进行性心功能障碍的中心环节。近年许多研究证实，CME所致心功能不全的发生机制与肿瘤坏死因子α(Tumornecrosisfactor-α,TNF-α)介导的炎症反应密切相关。在直径25um的微球造成的CME模型中，缺血心肌组织TNF-α表达显著升高，并主要位于白细胞浸润灶及微梗死灶周边；在应用糖皮质激素抗炎后，TNF-α表达水平明显下调，心功能亦有所提高；前期试验发现，CME后TNF-α、IL-1β、IL-10呈动态变化，并与左室功能改变密切相关。上述研究表明，炎症因子及其诱导的炎症反应是CME致心肌损伤的重要原因之一；而以TNF-α为首的炎症因子在CME致心肌损伤中起关键作用。作为一种炎症反应调节因子，核因子-κB(nuclearfacotr-κappaB，NF-κB)激活是急性炎症发生发展的最早始动环节之一。研究发现许多与炎症相关的蛋白如TNF-α、IL-1、IL-6、ICAM-1等细胞因子的基因都含有NF-κB的结合位点，当NF-κB受内外源性刺激由细胞浆向细胞核转移并活化后，即与上述炎症因子的基因相结合，从而启动转录与表达，使TNF-α、IL-1β等促炎因子及粘附因子、趋化因子和生物活性酶等炎性介质产生过多，导致炎症反应的放大乃至失控的炎症反应造成组织损伤和结构破坏。NF-κB信号转导通路通过介导免疫应答、炎症反应、细胞分化、增殖反应、细胞粘附、细胞凋亡、缺血再灌注损伤及蛋白酶基因表达等在心血管疾病中发挥重要作用。NF-κB的广泛活化及由此引起的TNF-α等炎性介质的大量释放在CME所致进行性心功能不全及晚期心力衰竭发生中起重要作用，而在应用NF-κB特异性抑制剂PDTC抑制其活性后，CME所致心肌局部炎症反应明显减弱并可显著改善心功能。因此，NF-κB信号通路的激活，进而引起各类炎性介质的大量释放在CME致心肌损伤中起关键作用，然而其具体的基因调控和分子机制尚不清楚，有待进一步深入研究。Toll样受体4(tolllikereceptor4，TLR4)是近年克隆出来连接先天免疫和特异性免疫的跨膜信号转导受体，主要介导细菌脂多糖(LPS)的跨膜信号传导，在心脏中也有较高水平的表达。TLR4与配体结合后最终导致核因子-κB(NF-κB)的活化，调控炎症和免疫相关基因的表达。一旦TLRs识别并结合DAMPs即可引起下游信号事件和转录因子激活，从而诱导免疫炎症反应的发生发展。研究证实，TLRs介导的免疫炎症反应主要是通过TLRs/NF-κB信号通路实现的。TLRs和相应配体结合后，主要通过MyD88依赖性途径将激活信号传递给胞浆中的NF-κB-IκB复合物，促使IκB磷酸化、泛素化并降解，与NF-κB分离，后者激活并转移至细胞核，与相应的炎症转录单位结合后导致炎性因子的合成和释放，并最终引起炎症反应的产生及扩大。研究证实，TLRs特别是TLR4介导的免疫炎症反应在心血管疾病中发挥了重要作用。Edfeld等研究显示在冠脉粥样硬化斑块中TLR4表达显著提高，且TLR4介导的信号通路与冠脉粥样硬化斑块相关炎症细胞因子的合成和释放密切相关；而TLR4基因缺陷小鼠在心肌缺血再灌(I/R)后，心梗面积较之野生型鼠显著减小，进一步研究发现，TLR4基因缺陷或使用拮抗剂可下调I/R引起的NF-κB活化，进而下调炎症因子的表达水平。在预实验中发现，CME后TLR4的表达水平要较假手术组的明显升高。因此，推测TLR4/NF-κB信号通路很有可能参与了CME所导致的心肌损伤。尼可地尔是具有扩张血管和开放钾通道双重活性的烟酰胺硝酸盐，能够激活细胞内鸟苷酸环化酶，使血管扩张，也能直接或者间接激活机体一氧化氮-蛋白激酶G通路，使细胞内流出的K+明显增加，引起细胞膜超极化，抑制钙离子向细胞内迁移，舒张冠状动脉，导致冠脉血流增加。此外，研究发现尼可地尔可以抑制TLR4介导的免疫炎症反应减少细胞损伤。近年来研究发现冠心病患者行PCI术前24-48小时静脉和/或冠脉内应用尼可地尔及口服常规剂量尼可地尔可以降低PCI围手术期心肌损伤的发生率，推测该效益可能归因于尼可地尔显著降低PCI过程中由微血栓造成的心梗发生率以及其抗炎作用，但其效应机制尚无深入的研究。预实验中也发现，CME前给予尼可地尔预处理后，心功能较单纯CME组有明显改善。综上所述，现有技术存在的问题是：冠状动脉微栓塞致心肌损伤，心肌收缩功能进行性下降，其分子和免疫机制目前尚不完全清楚。
技术实现思路
针对现有技术存在的问题，本专利技术提供了一种防治冠状动脉微栓塞致心肌损伤的药物及动物模型。本专利技术是这样实现的，一种防治冠状动脉微栓塞致心肌损伤的药物，所述防治冠状动脉微栓塞致心肌损伤的药物为尼可地尔。本专利技术的另一目的在于提供一种验证防治冠状动脉微栓塞致心肌损伤的药物的动物模型，所述验证防治冠状动脉微栓塞致心肌损伤的药物的动物模型为动物模型采用SD大鼠，以42μm微栓子制备冠脉微栓塞动物模型；选择CME后3h、6h、9h、12h、24h为观察时间点，在各时间点观察组中分为假手术组、CME组，待实验得出TLR4活性的高峰时间，根据此时间本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种防治冠状动脉微栓塞致心肌损伤的药物，其特征在于，所述防治冠状动脉微栓塞致心肌损伤的药物为尼可地尔。

【技术特征摘要】
1.一种防治冠状动脉微栓塞致心肌损伤的药物，其特征在于，所述防治冠状动脉微栓塞致心肌损伤的药物为尼可地尔。2.一种验证权利要求1所述防治冠状动脉微栓塞致心肌损伤的药物的动物模型，其特征在于，所述验证防治冠状动脉微栓塞致心肌损伤的药物的动物模型为动物模型采用SD大鼠，以42μm微栓子制备冠脉微栓塞动物模型；选择CME后3h、6h、9h、12h、24h为观察时间点，在各时间点观察组中分为假手术组、CME组，待实验得出TLR4活性的高峰时间，根据此时间点，再分为假手术组、CME组、CME+尼可地尔组、CME+TLR4抑制剂组。3.一种如权利要求2所述验证防治冠状动脉微栓塞致心肌损伤的药物的动物模型的构建方法，其特征在于，所述验证防治冠状动脉微栓塞致心肌损伤的药物的动物模型的构建方法包括：第一步，动物模型采用SD大鼠，以42μm微栓子制备冠脉微栓塞动物模型；第二步，选择CME后3h、6h、9h、12h、24h为观察时间点，在各时间点观察组中分为假手术组、CME组，待实验得出TLR4活性的高峰时间，根据此时间点，再分为假手术组、CME组、CME+尼可地尔组、CME+TLR4抑制剂组；第三步，心功能检测心功能各项指标，包括左室射血分数LVEF、左室舒张期末径LVEDd、短轴缩短率FS和心排血量CO；第四步，组织取材取左心室前壁心肌组织行分子生物机制检测；第五步，梗死区域测量石蜡包埋切片，苏木素伊红HE染色，苏木素碱性复红苦味酸染色法HBFP染色，相差显微镜检查，平面法测量坏死区域的百分比，显微镜下数码照相，软件计算梗死区域的绝对面积；第六步，实时荧光定量聚合酶链式反应RealTimePCR检测TLR4、MyD88以及TNF-α的mRNA表达；第七步，免疫印迹法检测TLR4、MyD88以及TNF-α蛋白表达水平；第八步，电泳迁移率转变分析评价NF-κB的活性；第九步，心肌酶学的检测取血清用ELISA方法行心肌酶学检查。4.如权利要求3所述的验证防治冠状动脉微栓塞致心肌损伤的药物的动物模型的构建方法，其特征在于，所述验证防治冠状动脉微栓塞致心肌损伤的药物的动物模型的构建方法中微栓塞球的制备，42μm微栓子，用生理盐水配制成106个/ml，使用前用超声震荡搅匀仪使微栓子混合均匀，常温下保存，每次使用前用超声振荡仪搅匀仪使微栓子混合均匀。5.如权利要求3所述的验证防治冠状动脉微栓塞致心肌损伤的药物的动物模型的构建方法，其特征在于，所述验证防治冠状动脉微栓塞致心肌损伤的药物的动物模型的构建方法中CME模型建立，8周龄成年SD大鼠雌雄不拘，体重250～300g，经尾静脉25mg/ml丙泊酚持续泵入麻醉，经口气管插管，连接呼吸机，于无菌手术台行后续操作；沿胸骨左缘3、4肋间钝性分离软组织，撑开肋骨，剥离心包；经左心室注射含45μm规格聚苯乙烯微球4000u的生理盐水悬浮液100μL，同时夹闭升主动脉20个心动周期；松开夹闭，关胸，逐层缝合，经尾静脉给予10000u青霉素预防感染，全程记录胸导联心电图；待大鼠自主呼吸恢复并麻醉苏醒后拔出气管导管，放回清洁饲养处。6.如权利要求3所述的验证防治冠状动脉微栓塞致心肌损伤的药物的动物模型的构建方法，其特征在于，所述验证防治冠状动脉微栓塞致心肌损伤的药物的动物模型的构建方法中首先按观察时间分为不同的时间观察组3h、6h、9h、12h、24h，n＝50，每组10只，假手术与CME组各5只；待实验得出TLR4活性的高峰时间，根据此时间点，再分为假手术组、CME组、CME+尼可地尔组、CME+TLR4抑制剂组，n＝20，每组5只；CME组：左心室内注入42μm的微栓塞球3000个；假手术组：...

【专利技术属性】
技术研发人员：苏强，吕祥威，叶自亮，
申请(专利权)人：桂林医学院附属医院，
类型：发明
国别省市：广西,45