川楝素在制备抗乳腺癌化疗增效药物中的应用制造技术

本发明专利技术的名称为川楝素在制备抗乳腺癌化疗增效药物中的应用，技术领域为本发明专利技术涉及川楝素逆转乳腺癌细胞对阿霉素耐受的新用途。本发明专利技术中，我们首次发现川楝素能显著增强阿霉素耐药的乳腺癌肿瘤细胞株MCF‑7/ADM对阿霉素诱导凋亡的敏感性。免疫荧光法显示川楝素明显促进阿霉素在耐药细胞MCF‑7/ADM中的积累，尤其是在细胞核中。进一步研究发现，川楝素能明显降低P‑gp蛋白表达水平。动物实验也表明川楝素和阿霉素联用对肿瘤有很好的抑制作用。这些结果表明川楝素联用阿霉素，能有效增强阿霉素对耐受性乳腺癌肿瘤的治效果。临床发现许多恶性肿瘤细胞对阿霉素具有耐药性，因此川楝素有较好的开发价值和应用前景。

【技术实现步骤摘要】
川楝素在制备抗乳腺癌化疗增效药物中的应用一、
本专利技术涉及川楝素逆转乳腺癌细胞对阿霉素耐受的新用途二、
技术介绍
在全球范围内，乳腺癌位居女性癌症发病之首，全球每年新发乳腺癌病例约167.1万，每年约52.2万死于乳腺癌，发达国家的乳腺癌发病相对欠发达国家更高。在我国，乳腺癌是最主要的恶性肿瘤之一。乳腺癌发病率位居城乡女性首位，是危害居民生命健康的最主要的恶性肿瘤之一，且我国居民的癌症发病率在近十几年总体呈现上升趋势。流行病学调查显示，全球范围内，其发病率不断上升，且呈年轻化趋势，已成为女性恶性肿瘤之首，严重威胁患者的生命健康。乳腺癌的诱发受到多种因素的综合影响。1、遗传因素是乳腺癌较为明确的危险因素，乳腺癌家族史尤其是一级亲属乳腺癌家族史对乳腺癌发病的影响最为直接。2、绝经时间晚为乳腺癌发生的危险因素，月经周期短、月经不规则也会增加乳腺癌的危险。母乳喂养可以降低乳腺癌的发病率。3、女性的一些日常生活习惯也与乳腺癌的发生息息相关。长期夜班族、饮食无规律亦是乳腺癌的危险因素，不规律的生活会使机体免疫力下降，内分泌失调，导致乳腺癌发病率增加。乳腺癌起源于乳腺各级别导管和腺泡上皮，由腺上皮增生到不典型增生而逐步发展为原位癌、早期浸润癌至浸润性癌。根据世界卫生组织乳腺肿瘤病理学可将乳腺癌分为乳腺导管癌、浸润性导管癌、小叶癌和三阴性乳腺癌四种。不同级别的导管发生的癌变，其组织类型常常不同。乳腺癌中95％以上是恶性上皮性肿瘤，乳腺肉瘤十分少见。在中国女性乳腺癌中，70％以上为浸润性导管癌，其他组织类型，如浸润性导管和小叶癌、浸润性小叶癌和浸润性小叶癌合并其他型癌等。如今，临床上治疗乳腺癌仍是以手术切除为主，放化疗和免疫疗法治疗为辅，而化疗又是辅助疗法中最常采用也是效果最好的一种方法。在术后进行的化疗称为辅助化疗，其作用主要是杀灭原发病灶切除后的残余瘤细胞。新辅助化疗即术前采用化疗，可以缩小乳腺癌原发肿瘤的体积，使部分肿瘤患者从最开始的不可切除转化为可以切除，使更多的乳腺癌患者可以进行保留乳房的手术，对于较晚期的乳腺癌患者，新辅助化疗也可以通过降低其分期达到保乳手术的目的。此外，新辅助化疗在保留乳腺、乳腺再建和淋巴结清扫手术中也有很大的益处。阿霉素为乳腺癌化疗的常用药。阿霉素对肿瘤细胞的作用有两个主要机制：①嵌入DNA，破坏拓扑异构酶II介导的DNA修复过程；②破坏自由基的生成，以及它对细胞膜，DNA，蛋白质的损伤。然而一些体外研究表明，有些肿瘤细胞对阿霉素诱导凋亡作用具有很强的耐受性。阿霉素耐药重要机制主要包括：①ABCB1(P-gp)和ABCC1(MRP1)和其他转运蛋白(ABCC3、ABCG2、ABCC2)可以将多种抗癌药物排出细胞外。②TOP2A(DNAtopoisomeraseIIalpha)的扩增，这已被证明能够影响治疗的响应率。TOP2A扩增与邻近基因HER-2(ERBB2)有着错综复杂的关系。而HER-2作为乳腺癌治疗，特别是曲妥珠单抗治疗的一个标志。HER-2基因的扩增也会影响阿霉素治疗的响应率。③细胞膜脂质的生物物理性质及与药物的相互作用。研究指出，在阿霉素敏感细胞MCF-7和耐药细胞MCF-7/ADM模型中，耐药细胞膜脂质表现出明显不同的组成，更加凝聚的结构，流体膜少以及与与药物的强疏水作用等特点。耐药细胞的细胞膜刚性性质抑制了药物吸收，从而影响了化疗疗效。④microRNA影响阿霉素耐药：有研究发现，microRNA-451能调节MDR1的表达，在MCF-7/ADM耐药细胞中转染microRNA-451有助于提高细胞对阿霉素的敏感性。⑤PI3K/AKT信号通路的激活。体外研究表明，PI3K/AKT的激活与阿霉素的化疗敏感性相关联。在乳腺癌治疗中结合常用的疗法，PI3K抑制剂LY294002增强了阿霉素、曲妥珠单抗、他莫昔芬引起的细胞凋亡。LY294002对化疗诱导的细胞凋亡的影响是通过AKT抑制导致的，这些研究表明，内源性AKT活性能促进乳腺癌患者的细胞存活和化疗耐药。研究表明，阿霉素耐受处理的乳腺癌细胞对阿霉素有明显的耐受性，但具体的机理目前并不清楚。为了增加阿霉素对乳腺癌肿瘤细胞的杀伤作用，有必要寻找新的策略以逆转阿霉素耐受的乳腺癌细胞株对阿霉素的耐受性，从而达到阿霉素更有效治疗乳腺癌的目的。川楝素(Toosendanin，TSN)是从传统中药川楝树的苦楝皮和川楝子中提取分离的一种四环三萜类化合物。作为天然中药药物成分，川楝素在驱虫、治疗肉毒毒素中毒、抗肿瘤、抑菌等多方面均显示出良好的生物活性和药理活性，极具开发研究价值。但是到目前为止，将川楝素用于肿瘤化疗增敏剂治疗乳腺癌并没有相关报道。三、
技术实现思路
阿霉素是目前临床上广泛使用的一种化疗药，是一种极具前景的抗癌药物。然而目前研究发现，许多恶性肿瘤细胞对阿霉素具有耐药性，使阿霉素在临床应用中遭遇瓶颈。川楝素在驱虫、治疗肉毒毒素中毒、抗肿瘤、抑菌等多方面均显示出良好的生物活性和药理活性。本专利技术中，我们首次发现川楝素能显著增强阿霉素耐药的乳腺癌肿瘤细胞株MCF-7/ADM对阿霉素诱导凋亡的敏感性。在其他的乳腺癌细胞株中，川楝素也能明显增强人源三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231，468细胞系以及鼠源乳腺癌细胞系4T1对阿霉素诱导凋亡的敏感性。免疫荧光法显示川楝素明显促进阿霉素在耐药细胞MCF-7/ADM中的积累，尤其是在细胞核中。进一步研究发现，川楝素能明显降低P-gp蛋白表达水平。动物实验也表明川楝素和阿霉素联用对肿瘤有很好的抑制作用。这些结果表明川楝素联用阿霉素，能有效增强阿霉素对耐受性乳腺癌肿瘤的治疗效果。四、附图说明图1不同浓度的阿霉素对MCF-7和MCF-7/ADM凋亡作用图2川楝素增强MCF-7/ADM细胞对阿霉素的敏感性图3川楝素与阿霉素联用时MCF-7/ADM细胞中PARP的剪切水平图4川楝素和阿霉素对MDA-MB-231，MDA-MB-468，4T1凋亡作用图5免疫荧光检测川楝素对MCF-7/ADM细胞中阿霉素亚细胞分布的影响图6RT-PCR检测耐药相关基因在MCF-7/WT，MCF-7/ADM中的表达图7Westernblotting检测P-gp在MCF-7，MCF-7/ADM中表达图8RT-PCR检测川楝素对耐药乳腺癌细胞中耐药相关基因表达的影响图9Westernblotting检测川楝素处理时乳腺癌耐药细胞MCF-7/ADM中P-gp的蛋白表达图10Westernblotting检测不同浓度川楝素处理对乳腺癌耐药细胞MCF-7/ADM中P-gp的蛋白表达的影响图11小鼠肿瘤组织图12小鼠肿瘤组织生长曲线图13小鼠肝脏和肾脏的HE染色五、具体实施方式5.1实验材料、试剂细胞：人源乳腺癌细胞株MCF-7和人源阿霉素耐药乳腺癌细胞株MCF-7/ADM购自中国医学科学院肿瘤医院肿瘤研究所，人源乳腺癌细胞株MDA-MB-231、MDA-MB-468、鼠源乳腺癌细胞株4T1均来源于美国ATCC细胞库，以上细胞均用含10％的FBS、1％的链霉素青霉素双抗RPMI1640培养基培养。分子试剂：川楝素Toosendanin(TSN，purity≥98％)(NationalInstitutesforFoodandDrugCo本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.川楝素在制备抗乳腺癌化疗药物增敏剂中的应用。

【技术特征摘要】
1.川楝素在制备抗乳腺癌化疗药物增敏剂中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，所述川楝素的...

【专利技术属性】
技术研发人员：殷武，闪雅婷，王凯，李信，殷放宙，
申请(专利权)人：南京大学，南京苛麦可医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32