一种液质联用测定血浆中头孢氨苄浓度的方法技术

本发明专利技术公开了一种液质联用测定血浆中头孢氨苄浓度的方法，采用液质联用系统测定，先取待测样品，加入一定量的混合有机溶剂进行萃取两次，预处理后，经色谱柱分离，用质谱检测器检测。本发明专利技术方法快速、准确、灵敏度高、操作简便，为头孢氨苄的血药浓度测定提供依据；本方法的血浆标准曲线线性范围为0.1～50ug/mL，批内和批间精密度RSD均小于±15％，适合于测定血浆中头孢氨苄的浓度。

A method for determination of Cefalexin in plasma by liquid chromatography-mass spectrometry

The invention discloses a method for determining the concentration of Cefalexin in plasma by liquid chromatography-mass spectrometry. The method adopts liquid chromatography-mass spectrometry system to determine the concentration of Cefalexin in plasma. Samples to be measured are extracted twice by adding a certain amount of mixed organic solvents. After pretreatment, they are separated by chromatographic column and detected by mass spectrometry detector. The method is fast, accurate, sensitive and easy to operate, and provides a basis for the determination of Cefalexin in plasma. The linear range of the plasma standard curve of the method is 0.1-50ug/mL, and the RSD of intra-and inter-batch precision is less than (+15). The method is suitable for the determination of Cefalexin in plasma.

【技术实现步骤摘要】
一种液质联用测定血浆中头孢氨苄浓度的方法
本专利技术属于医药
，具体涉及一种药物的测定方法，特别涉及一种液质联用测定血浆中头孢氨苄浓度的方法。
技术介绍
细菌感染是致病菌或条件致病菌侵入血循环中生长繁殖，产生毒素和其他代谢产物所引起的急性全身性感染，临床上以寒战、高热、皮疹、关节痛及肝脾肿大为特征，部分可有感染性休克和迁徙性病灶。头孢氨苄为美国EliLilly公司1970年上市的半合成口服头孢类抗生素，其通过抑制细胞壁的合成，使细胞内容物膨胀至破裂溶解，从而达到杀菌作用。该品为广谱抗生素，对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均有抗菌作用，注射后吸收迅速而完全，生物利用率高，特别加入增效抗炎因子，使该品具有标本兼治得效果，其杀菌能力比青霉素类大20倍，比磺胺类大10倍、比喹诺酮类大5倍。头孢氨苄吸收良好，空腹口服该品0.5g后1h达血药峰浓度，平均为18mg/L；血消除半衰期(t1/2)为0.6～1.0h，加服丙磺舒可提高血药浓度，t1/2b可延长至1.8h；肾衰竭时t1/2b可延长至5～30h；新生儿t1/2b为6.3h。该品吸收后广泛分布于各组织体液中；可透过胎盘进入胎儿血循环，产妇羊水；约5％的口服给药量自胆汁排出；血清蛋白结合率为10％～15％；该品体内不代谢，24小时尿中累积排出给药量的80％～90％。目前，用于检测头孢氨苄的方法主要有微生物法、色谱法或色谱-质谱联用分析法、免疫分析法等。微生物检测法操作简单，但其检测周期长且结果误差较大。免疫分析法技术虽然检测速度快，但是应用于该技术的免疫层析检测试纸条或试纸盒的制作工艺繁琐，制作成本高。专利技术内容本专利技术的目的在于提供一种液质联用测定血浆中头孢氨苄浓度的方法，该方法可提高检测的速度、精度和灵敏度。为实现上述目的，一种液质联用测定血浆中头孢氨苄浓度的方法，血浆样品经预处理后经高效液相色谱-串联质谱检测其浓度，具体方法包括以下步骤：(1)血浆样品预处理：以K2EDTA为抗凝剂，以头孢氨苄-d5为内标；于96深孔板中精密加入100uL的血浆样品，加入5uL体积分数为98％的乙腈水溶液，混匀后加入5uL的0.04ug/uL的内标头孢氨苄-d5溶液，混匀后加入1000uL乙腈于96深孔板中，涡旋混合1min，于6℃以3000rpm离心10min，取上层清液20uL至装有980uL混合有机溶剂的96深孔板中，混合有机溶剂为水：甲酸：1mol/L的醋酸铵按照体积比100：0.1：0.1混合得到的混合物，涡旋混匀，于6℃以3000rpm离心5min后作为测试样品待检测；以上过程中除了涡旋和离心，其他过程均需与冰浴条件下操作；(2)试样测定：取10uL测试样品注入高效液相色谱-串联质谱仪中，检测样品中头孢氨苄和内标头孢氨苄-d5的色谱峰，并据此计算所述血浆样品中的头孢氨苄浓度；(3)液相色谱条件：色谱柱：AgilentZORBAXXDB-C18，5um，柱规格为50×2.1mm；色谱柱温：40℃；流动相A：水/甲酸的体积百分比为100/0.1；流动相B：乙腈/甲酸的体积百分比为100/0.1；洗液：乙腈/水的体积百分比为50/50；自动进样器温度为6℃；梯度洗脱，流速为0.4mL/min，进样量为10uL，分析时间3.5min；(4)质谱条件：离子源为电喷雾离子源，喷雾电压为5500V，雾化温度为500℃，喷雾气压力为14Psi，辅助加热气压力为14Psi，气帘气压力为30Psi，碰撞气压力为8Psi，去簇电压分别为27eV的头孢氨苄和头孢氨苄-d5；碰撞室入口电压分别为10eV的头孢氨苄和头孢氨苄-d5；碰撞电压分别为40eV的头孢氨苄和头孢氨苄-d5；碰撞室出口电压分别为10eV的头孢氨苄和头孢氨苄-d5；正离子方式检测；扫描方式为多重反应监测；用于定量分析的离子反应分别为：m/z347.9→m/z106.1，其为头孢氨苄；和m/z352.9→m/z111.1，其为头孢氨苄-d5。优选的，所述步骤(3)中梯度洗脱的程序为：优选的，所述步骤(2)中，采用内标法，以头孢氨苄和内标头孢氨苄-d5的峰面积比值带入标准曲线方程计算所述血浆样品中的头孢氨苄的浓度。优选的，所述标准曲线方程的建立包括以下步骤：取100uL空白血浆10份置于96深孔板中，以贮备液的形式添加5uL浓度分别为0.002μg/μl，0.004μg/μl，0.01μg/μl，0.02μg/μl，0.1μg/μl，0.2μg/μl，0.6μg/μl，1μg/μl的头孢氨苄溶液至最低定量下限样本、标样1、标样2、标样3、标样4、标样5、标样6、最高定量上限样本中，分别添加5μl的体积分数为98％的乙腈水溶液至空白样本和零浓度样本，混匀后分别向最低定量下限样本、标样1、标样2、标样3、标样4、标样5、标样6、最高定量上限样本、零浓度样本中加入5uL的0.01ug/uL的内标头孢氨苄-d5溶液，向空白样本中加入5μl的体积分数为98％的乙腈水溶液，混匀后分别向10份样本中加入1000uL的乙腈，涡旋混合1min，于6℃以3000rpm离心10min，分别取上层清液20uL至装有980uL混合有机溶剂的96深孔板中，混合有机溶剂为水：甲酸：1mol/L的醋酸铵按照体积比100：0.1：0.1混合得到的混合物，涡旋混匀，于6℃以3000rpm离心5min后作为10份标准样品待检测；以上过程中除了涡旋和离心，其他过程均需于冰浴条件下操作；分别取10uL标准样品注入高效液相色谱-串联质谱仪中，检测样品中的头孢氨苄和内标头孢氨苄-d5的色谱峰，并据此得到标准曲线，以用于计算所述血浆中的头孢氨苄的浓度。与现有技术相比，本专利技术具有以下优点：(1)预处理方法简便，两步有机溶液萃取，适用于常规测定；(2)专属性强：在本实验所采用的色谱条件下，头孢氨苄保留时间为1.648min左右，内标头孢氨苄-d5保留时间在1.637min左右。头孢氨苄和内标头孢氨苄-d5的峰形良好，无杂峰干扰测定，基线平稳；(3)灵敏度高：血浆最低定量限为0.1ug/mL，能准确测定血浆中头孢氨苄的浓度，灵敏度高，特异性强；(4)本专利技术方法快速、准确、灵敏度高、操作简便，为头孢氨苄的血药浓度测定提供依据。本方法的血浆标准曲线线性范围为0.1～50ug/mL，批内和批间精密度RSD均小于±15％。附图说明图1为HPLC-MS/MS法测得的头孢氨苄在人血浆中的标准曲线图；图2为人空白血浆的HPLC-MS/MS图；图3为人空白血浆加入头孢氨苄和头孢氨苄-d5的HPLC-MS/MS图；图4为健康受试者口服头孢氨苄药物后血浆样品再加入内标头孢氨苄-d5的HPLC-MS/MS图。具体实施方式以下结合实施例对本专利技术作进一步详细说明。实施例：人类K2EDTA血浆中头孢氨苄浓度的测定一、实验材料与分析设备头孢氨苄(分析物)：中国食品药品检定研究院或相同、更高等级的标准品头孢氨苄-d5(内标)：TorontoResearchChemicals或相同、更高等级的标准品使用试剂见下表1：表1试剂明细试剂名称级别制造商乙腈HPLCJ.T.Baker醋酸铵HPLCJ.T.Baker甲酸ACSAdamas注：亦可使用相同级别或更高级别的试剂使用分析设备见下表2：表2使用设本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种液质联用测定血浆中头孢氨苄浓度的方法，其特征在于：血浆样品经预处理后经高效液相色谱‑串联质谱检测其浓度，具体方法包括以下步骤：(1)血浆样品预处理：以K2EDTA为抗凝剂，以头孢氨苄‑d5为内标，于96深孔板中精密加入100uL的血浆样品，加入5uL体积分数为98％的乙腈水溶液，混匀后加入5uL的0.04ug/uL的内标头孢氨苄‑d5溶液，混匀后加入1000uL乙腈于96深孔板中，涡旋混合1min，于6℃以3000rpm离心10min，取上层清液20uL至装有980uL混合有机溶剂的96深孔板中，混合有机溶剂为水：甲酸：1mol/L的醋酸铵按照体积比100：0.1：0.1混合得到的混合物，涡旋混匀，于6℃以3000rpm离心5min后作为测试样品待检测；以上过程中除了涡旋和离心，其他过程均需于冰浴条件下操作；(2)试样测定：取10uL测试样品注入高效液相色谱‑串联质谱仪中，检测样品中头孢氨苄和内标头孢氨苄‑d5的色谱峰，并据此计算所述血浆样品中的头孢氨苄浓度；(3)液相色谱条件：色谱柱：Agilent ZORBAX XDB‑C18，5um，柱规格为50×2.1mm；色谱柱温：40℃；流动相A：水/甲酸的体积百分比为100/0.1；流动相B：乙腈/甲酸的体积百分比为100/0.1；洗液：乙腈/水的体积百分比为50/50；自动进样器温度为6℃；梯度洗脱，流速为0.4mL/min，进样量为10uL，分析时间3.5min；(4)质谱条件：离子源为电喷雾离子源，喷雾电压为5500V，雾化温度为500℃，喷雾气压力为14Psi，辅助加热气压力为14Psi，气帘气压力为30Psi，碰撞气压力为8Psi，去簇电压分别为27eV的头孢氨苄和头孢氨苄‑d5；碰撞室入口电压分别为10eV的头孢氨苄和头孢氨苄‑d5；碰撞电压分别为40eV的头孢氨苄和头孢氨苄‑d5；碰撞室出口电压分别为10eV的头孢氨苄和头孢氨苄‑d5；正离子方式检测；扫描方式为多重反应监测；用于定量分析的离子反应分别为：m/z347.9→m/z106.1，其为头孢氨苄；和m/z352.9→m/z111.1，其为头孢氨苄‑d5。...

【技术特征摘要】
1.一种液质联用测定血浆中头孢氨苄浓度的方法，其特征在于：血浆样品经预处理后经高效液相色谱-串联质谱检测其浓度，具体方法包括以下步骤：(1)血浆样品预处理：以K2EDTA为抗凝剂，以头孢氨苄-d5为内标，于96深孔板中精密加入100uL的血浆样品，加入5uL体积分数为98％的乙腈水溶液，混匀后加入5uL的0.04ug/uL的内标头孢氨苄-d5溶液，混匀后加入1000uL乙腈于96深孔板中，涡旋混合1min，于6℃以3000rpm离心10min，取上层清液20uL至装有980uL混合有机溶剂的96深孔板中，混合有机溶剂为水：甲酸：1mol/L的醋酸铵按照体积比100：0.1：0.1混合得到的混合物，涡旋混匀，于6℃以3000rpm离心5min后作为测试样品待检测；以上过程中除了涡旋和离心，其他过程均需于冰浴条件下操作；(2)试样测定：取10uL测试样品注入高效液相色谱-串联质谱仪中，检测样品中头孢氨苄和内标头孢氨苄-d5的色谱峰，并据此计算所述血浆样品中的头孢氨苄浓度；(3)液相色谱条件：色谱柱：AgilentZORBAXXDB-C18，5um，柱规格为50×2.1mm；色谱柱温：40℃；流动相A：水/甲酸的体积百分比为100/0.1；流动相B：乙腈/甲酸的体积百分比为100/0.1；洗液：乙腈/水的体积百分比为50/50；自动进样器温度为6℃；梯度洗脱，流速为0.4mL/min，进样量为10uL，分析时间3.5min；(4)质谱条件：离子源为电喷雾离子源，喷雾电压为5500V，雾化温度为500℃，喷雾气压力为14Psi，辅助加热气压力为14Psi，气帘气压力为30Psi，碰撞气压力为8Psi，去簇电压分别为27eV的头孢氨苄和头孢氨苄-d5；碰撞室入口电压分别为10eV的头孢氨苄和头孢氨苄-d5；碰撞电压分别为40eV的头孢氨苄和头孢氨苄-d5；碰撞室出口电压分别为10eV的头孢氨苄和头孢氨苄-d5；正离子方式检测；扫描方式为多重反应监测；用于定量分析的离子反应分别为：m/z...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄靖智，
申请(专利权)人：徐州立兴佳正医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32