染色体1p/19q联合杂合性缺失的检测方法及试剂盒技术

本发明专利技术公开了一种染色体1p/19q联合杂合性缺失的检测方法，步骤包括：1）在1p和19q上选择相同数量的SNP位点；2）设计原始引物，将每条原始引物最靠近3’端但非末尾的T修改为U，若3’端末尾为T，则将往5’方向的第2个T修改为U，获得多重扩增引物序列；3）合成多重扩增引物并溶解混合；4）多重PCR扩增；5）处理扩增产物，使U的单链形成一AP位点，再暴露出AP位点的5’磷酸和3’磷酸末端；6）测序，根据SNP等位型频率判断该染色体是否发生1p/19q联合杂合性缺失。本发明专利技术基于多重扩增子的NGS方法检测Chr1p/19q co‑LOH，不仅检测灵敏度、特异性和效率高，而且对样本限制小。

Detection method and kit of chromosome 1p/19q combined heterozygosity deletion

The invention discloses a method for detecting chromosome 1p/19q combined heterozygosity deletion. The steps include: 1) selecting the same number of SNP loci on 1p and 19q; 2) designing original primers, modifying each original primer's T nearest to the 3'end but not the end to U, and if the 3' end to T, modifying the second T in the 5'direction to U to obtain multiple amplified primer sequences; 3) synthesizing more primers; Repeat primers and dissolve mixtures; 4) multiplex PCR amplification; 5) process the amplified products to form an AP site in the single chain of U, then expose the 5'phosphoric acid and 3'phosphoric acid terminal of AP site; 6) Sequence, and determine whether the chromosome has 1p/19q joint heterozygosity deletion according to SNP allele frequency. The invention detects Chr1p/19q co_LOH by NGS method based on multiple amplifiers, which has not only sensitivity, specificity and high efficiency, but also small sample limitation.

【技术实现步骤摘要】
染色体1p/19q联合杂合性缺失的检测方法及试剂盒
本专利技术涉及生物医学领域，特别是涉及染色体1p/19q联合杂合性缺失的检测及用于该项检测的试剂盒。
技术介绍
人类1号染色体短臂末端1p36和19号染色体长臂19q13.3区域内集中了许多与细胞生长调控以及增殖分化密切相关的重要基因。在脑胶质瘤中，染色体1p/19q的联合杂合性缺失（Chr1p/19qco-LOH）具有重要的临床意义。Chr1p/19qco-LOH与组织学分型中的少突胶质细胞瘤（oligodendroglioma）相关。2016年WHO中枢神经系统肿瘤分类中，推荐对该指标进行分子病理学检测（参见图1），这一指标对于低级别胶质瘤的病理分型具有重要意义，是低级别胶质瘤病理分型的重要依据。Chr1p/19qco-LOH提示患者可能对烷化剂类抗肿瘤药物（如替莫唑胺）较为敏感，对同步放化疗较为敏感。统计数据表明，发生Chr1p/19qco-LOH的胶质瘤患者预后较好（参见https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23429602；https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubm本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.染色体1p/19q联合杂合性缺失的检测方法，其特征在于，步骤包括：1）在1号染色体短臂1p和19号染色体长臂19q上分别选择相同数量的SNP位点；2）根据步骤1）选择的位点，设计适用于多重扩增的原始引物，然后将每条原始引物最靠近3’端但不是末尾的T修改为U，如果3’端末尾为T，则将往5’方向的第2个T修改为U，获得多重扩增引物序列；3）合成步骤2）所得多重扩增引物，并进行溶解混合；4）进行多重PCR扩增反应；5）用尿嘧啶DNA糖基化酶处理步骤4）所得扩增产物，使U的单链形成一个AP位点；再用核酸内切酶Ⅷ分别在AP位点的3’和5’端切割磷酸二酯键，产生5’磷酸末端和3’磷酸末端；6）构建测序...

【技术特征摘要】
1.染色体1p/19q联合杂合性缺失的检测方法，其特征在于，步骤包括：1）在1号染色体短臂1p和19号染色体长臂19q上分别选择相同数量的SNP位点；2）根据步骤1）选择的位点，设计适用于多重扩增的原始引物，然后将每条原始引物最靠近3’端但不是末尾的T修改为U，如果3’端末尾为T，则将往5’方向的第2个T修改为U，获得多重扩增引物序列；3）合成步骤2）所得多重扩增引物，并进行溶解混合；4）进行多重PCR扩增反应；5）用尿嘧啶DNA糖基化酶处理步骤4）所得扩增产物，使U的单链形成一个AP位点；再用核酸内切酶Ⅷ分别在AP位点的3’和5’端切割磷酸二酯键，产生5’磷酸末端和3’磷酸末端；6）构建测序文库，进行高通量二代测序，根据SNP等位型频率判断该染色体是否发生1p/19q联合杂合性缺失。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1），一部分SNP选自1p36.3区段和19q13.3区段；另一部分SNP的选择标准为：该SNP为杂合型的概率在人群中接近50%，且该SNP在基因组中的距离大于300kb。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤1），1p和19q上各选择10个SNP位点，其中，1p上5个SNP位于1p36.3区段，19q上5个SNP位于19q13.3区段。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2）所述原始引物的序列如SEQIDNO:1～SEQIDNO:40所示；所述多重扩增引物序列如SEQIDNO:41～SEQIDNO:80所示。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤4），PCR反应体系包括：2×PlatinumMultiplexPCRMasterMix15µl，80µM多重扩增混合引物10µl，1ng/µl样本DNA5µl，总体积30...

【专利技术属性】
技术研发人员：魏金旺，张敖，王晨，戴春，许强，
申请(专利权)人：领星生物科技上海有限公司，上海领安生物科技有限公司，启东领星医学检验所有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31