新的噬菌体、其组合物以及它们的制备方法和应用技术

本发明专利技术涉及微生物领域，本发明专利技术提供了新的沙门氏菌噬菌体、其组合物、它们的制备方法和应用，本发明专利技术所述新的沙门氏菌噬菌体为肌尾噬菌体BP‑66(Myoviridae sp.BP‑66)、保藏编号CCTCC NO：M2015146，肌尾噬菌体BP‑63(Myoviridae sp.BP‑63)保藏编号CCTCC NO：M2015145，长尾噬菌体BP‑12(Chilikevirus sp.BP‑12)保藏编号CCTCC NO：M2015141。本发明专利技术所述新的噬菌体为严格的烈性噬菌体且对宿主菌具有高毒性，具有较广的宿主范围，低浓度下依然对宿主菌具有高毒性；所述噬菌体的DNA无法编码可能引起潜在健康风险的蛋白；于培养液中室温下稳定存活，4℃下超过6个月；而且在非致病性细菌宿主上可较好增殖；可实现大规模工业生产。本发明专利技术所述沙门氏菌噬菌体能为噬菌体疗法的应用提供优良的菌株资源。

New bacteriophages, their compositions, their preparation methods and Applications

The invention relates to the field of microorganisms. The invention provides a new Salmonella bacteriophage, its composition, its preparation method and application. The new Salmonella bacteriophage of the invention is muscle tail bacteriophage BP 66 (Myoviridae sp. BP 66), storage number CCTCC NO: M2015146, muscle tail bacteriophage BP 63 (Myoviridae sp. BP 63) storage number CCTCC NO: M2015145, and long tail bacteriophage. Preservation No. CCTCC NO: M2015141 of Chilikevirus sp. BP 12. The new bacteriophage of the present invention is a strict and intense bacteriophage with high toxicity to host bacteria, has a wide host range, and is still highly toxic to host bacteria at low concentrations; the DNA of the bacteriophage can not encode proteins that may cause potential health risks; it can survive stably at room temperature in culture medium for more than 6 months at 4 degrees Celsius; and it can be compared with non-pathogenic bacterial hosts. Good proliferation; can achieve large-scale industrial production. The Salmonella bacteriophage of the invention can provide excellent strain resources for the application of bacteriophage therapy.

【技术实现步骤摘要】
新的噬菌体、其组合物以及它们的制备方法和应用本申请为申请号201510308565.0，申请日2015年06月09日，专利技术名称为“新的噬菌体、其组合物以及它们的制备方法和应用”的分案申请。
专利技术属于微生物
，具体涉及新的沙门氏菌噬菌体性、其组合物以及它们的制备方法和应用。
技术介绍
沙门氏菌被认为是目前世界范围内最重要的食源性致病菌之一，据资料统计，我国发生的食源性疾病，70％-80％是由沙门氏菌引起的。由于沙门氏菌血清型众多，在自然界分布广泛，可通过污染蛋类、肉类、奶类等食品导致人类食物中毒；家禽被沙门氏菌感染后出现禽伤寒、禽副伤寒、鸡白痢等疾病。沙门氏菌属目前有肠道沙门氏菌和邦戈尔沙门氏菌2个种。有资料报道，截止2007年底有2700种以上的血清型，分属46个O群，而我国检测到的血清型达290种以上。现今生产中抗生素的滥用使许多细菌出现了耐药性，而耐药菌株在临床病人中不断增多，特别是多耐药株，将严重地危及到感染病人的治疗效果。这使得沙门氏菌病原菌的防治面临严峻挑战。噬菌体是一类细菌依赖性病毒，可以侵染细菌，并在菌体内繁殖使细菌裂解而杀灭细菌。噬菌体作为细菌的天然克星，在控制细菌感染方面有着突出的优越性。早在20世纪初，用噬菌体治疗细菌感染就取得过积极的效果。因其对于特异性宿主菌具有裂解作用，因此可考虑到将噬菌体作为一种抗细菌感染的制剂来使用。李梦哲(宽谱沙门氏菌噬菌体STP4-a的发酵制备及其在蛋鸡体内的抑菌研究[D].中国海洋大学硕士学位论文,2014)发现沙门氏菌噬菌体STP4-a可识别沙门氏菌，其裂解率为80.04％；包红朵等(腐败希瓦氏菌噬菌体的性质和防腐应用研究[D].中国海洋大学硕士学位论文,2012.)发现沙门氏菌噬菌体PSA-6a可裂解5株沙门氏菌及1株大肠杆菌。CN200980000314.9公开了新型噬菌体和包含所述噬菌体的抗菌组合物，以用于治疗和预防鸡沙门氏菌的传染病的治疗；CN201010508259.9公开了一株沙门氏菌噬菌体及其应用，以用于控制沙门氏菌对食品和器具的污染。目前，如何丰富广谱性噬菌体资源，寻找强裂解性新的噬菌体是本
对于沙门氏菌病原菌防治中急需解决的问题。而从污水中筛选烈性噬菌体是研发新型抑菌制剂以促进噬菌体疗法发展的一条有效途径。
技术实现思路
针对以上技术情况，本专利技术提供了新的沙门氏菌噬菌体、其组合物以及它们的制备方法和应用，本专利技术所述噬菌体为肌尾噬菌体BP-66(Myoviridaesp.BP-66)、肌尾噬菌体BP-63(Myoviridaesp.BP-63)或长尾噬菌体BP-12(Chilikevirussp.BP-12)，其中所述肌尾噬菌体BP-66(Myoviridaesp.BP-66)的保藏单位为中国典型培养物保藏中心，地址为湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学，邮编430072；保藏日期为2015年3月23日；保藏编号为CCTCCNO：M2015146，所述肌尾噬菌体BP-63(Myoviridaesp.BP-63)的保藏单位为中国典型培养物保藏中心，地址为湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学，邮编430072；保藏日期为2015年3月23日；保藏编号为CCTCCNO：M2015145；所述长尾噬菌体BP-12(Chilikevirussp.BP-12)的保藏单位为中国典型培养物保藏中心，地址为湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学，邮编430072；保藏日期为2015年3月23日；保藏编号为CCTCCNO：M2015141。作为本专利技术实施方案之一，所述肌尾噬菌体BP-66具有SEQIDNO：1的核苷酸序列；肌尾噬菌体BP-63具有SEQIDNO：2的核苷酸序列；或长尾噬菌体BP-12具有SEQIDNO：3的核苷酸序列。经测序发现肌尾噬菌体BP-66与肌尾噬菌体BP-63具有相同的核苷酸序列，它们之间却具有不同的特性，例如包括但不限于：1、噬菌体之间的压力耐受性几乎相差两倍；2、在裂解谱测定中，对于DT193A这株细菌，肌尾噬菌体BP-66能裂解，但是肌尾噬菌体BP-63不能裂解；3、在同一浓度的裂解能力上，肌尾噬菌体BP-66的裂解能力更高。本专利技术所述肌尾噬菌体BP-66、肌尾噬菌体BP-63、长尾噬菌体BP-12是从加拿大蒙特利尔污水处理厂中分离出的。其中，肌尾噬菌体BP-66的生物学特征为：在电子显微镜下观察BP-66噬菌体形态发现，其为有尾噬菌体，无折叠，具有短收缩尾部与线性双链DNA(图4)，基于其独特的大小及形态，根据病毒分类国际委员会(ICTV)定义，该噬菌体被系统分类为肌尾噬菌体科(Myoviridae)。肌尾噬菌体BP-63的生物学特征：在电子显微镜下观察BP-63噬菌体形态发现，其为有尾噬菌体，无折叠，具有短收缩尾部与线性双链DNA(图5)，基于其独特的大小及形态，根据病毒分类国际委员会(ICTV)定义，该噬菌体被系统分类为肌尾噬菌体科(Myoviridae)。长尾噬菌体BP-12的生物学特征：在电子显微镜下观察BP-12噬菌体形态发现，其为有尾噬菌体，无折叠，具有长且无收缩尾部与线性双链DNA(图6)，基于其独特的大小及形态，根据病毒分类国际委员会(ICTV)定义，该噬菌体被系统分类为长尾噬菌体科(Siphoviridae)。肌尾噬菌体BP-66全基因组序列大小为40kb(图7)。将序列与局部序列排比检索基本工具中现存的所有噬菌体序列进行比对。通过BLAST程序计算比对的显著差异。采用核酸比对程序(megablast)搜索相似度较高的序列以及更多不相同的序列。结果表明，噬菌体BP-66与肌尾噬菌体科的相似度最高。结合形态特征和全基因组序列分析，噬菌体BP-66鉴定为肌尾噬菌体BP-66(Myoviridaesp.BP-66)。肌尾噬菌体BP-66(Myoviridaesp.BP-66)具有如SEQIDNO：1的核苷酸序列。肌尾噬菌体BP-63全基因组序列大小为40kb(图7)。将序列与局部序列排比检索基本工具中现存的所有噬菌体序列进行比对。通过BLAST程序计算比对的显著差异。采用核酸比对程序(megablast)搜索相似度较高的序列以及更多不相同的序列。结果表明，BP-63噬菌体序列与可对比噬菌体序列相似度均较低，小于70％。依其形态特征可将BP-63噬菌体分类为肌尾噬菌体科(Myoviridae)，但序列比对结果显示其与已知噬菌体亲缘关系均较远，无法进行匹配。因此BP-63可鉴定为肌尾噬菌体BP-63(Myoviridaesp.BP-63)。肌尾噬菌体BP-63(Myoviridaesp.BP-63)具有SEQIDNO：2的核苷酸序列。长尾噬菌体BP-12全基因组序列大小为40kb(图7)。将序列与局部序列排比检索基本工具中现存的所有噬菌体序列进行比对。通过BLAST程序计算比对的显著差异。采用核酸比对程序(megablast)搜索相似度较高的序列以及更多不相同的序列。结果表明，BP-12噬菌体与长尾噬菌体科Chilikevirus属的相似度最高。结合形态特征和全基因组序列分析，BP-12噬菌体鉴定为长尾噬菌体BP-12(Chilikevirussp.BP-12)。所述长尾噬菌体BP-12(Chilikevir本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.新的噬菌体，其特征在于，所述噬菌体为肌尾噬菌体BP‑63(Myoviridae sp.BP‑63)，其中肌尾噬菌体BP‑63的保藏编号为CCTCC NO：M 2015145。

【技术特征摘要】
1.新的噬菌体，其特征在于，所述噬菌体为肌尾噬菌体BP-63(Myoviridaesp.BP-63)，其中肌尾噬菌体BP-63的保藏编号为CCTCCNO：M2015145。2.根据权利要求1所述的噬菌体，其特征在于，所述肌尾噬菌体BP-63(Myoviridaesp.BP-63)为SEQIDNO：2的核苷酸序列。3.根据权利要求1或2所述的噬菌体，其特征在于，所述肌尾噬菌体BP-63(Myoviridaesp.BP-63)不含毒力基因或不良基因。4.根据权利要求1或2所述的噬菌体，其特征在于，所述肌尾噬菌体BP-63(Myoviridaesp.BP-63)不识别非致病性细菌。5.根据权利要求4所述的噬菌体，其特征在于，所述非致病性细菌包括肌尾噬菌体BP-63(Myoviridaesp.BP-63)不可识别表9中57株非致病性细菌。6.根据权利要求1或2所述的噬菌体，其特征在于，所述肌尾噬菌体BP-63(Myoviridaesp.BP-63)不识别非宿主性致病性细菌。7.根据权利要求6所述的噬菌体，其特征在于，所述非宿主性致病细菌为表10中184株致病性细菌。8.权利要求1-7任一所述肌尾噬菌体BP-63(Myoviridaesp.BP-63)在制备裂解沙门氏菌的产品中的应用。9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述的沙门氏菌包括肌尾噬菌体BP-63(Myoviridaesp.BP-63)可裂解表7中35株血清型沙门氏菌。10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述沙门氏菌包括肌尾噬菌体BP-63(Myoviridaesp.BP-63)可裂解表8中22株不同血清型肠道沙门氏菌。11.权利要求1所述肌尾噬菌体BP-63(Myoviridaesp.BP-63)的发酵方法：2-1)取肌尾噬菌体BP-63(Myoviridaesp.BP-63)的菌落，接种到LB培养液中...

【专利技术属性】
技术研发人员：霍茨蒙德·曼德维尔，
申请(专利权)人：菲吉乐科南京生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32