骨质疏松特异性miRNA、组合物及其诊疗用途制造技术

本发明专利技术涉及骨质疏松特异性miRNA、组合物及其诊疗用途，具体的涉及miR‑1468‑5p、miR‑629‑5p及其组合物在制备骨质疏松诊断和治疗制剂中的应用。申请人通过高通量测序，并运用生物信息学方法进行分析，发现与骨质疏松相关的miRNA，荧光定量PCR实验和细胞实验进行分子生物学验证，本发明专利技术为临床绝经后骨质疏松的精准诊断提供了潜在的分子标志物。

Specific microRNAs and compositions for osteoporosis and their diagnostic and therapeutic uses

The invention relates to osteoporosis-specific microRNAs, compositions and their diagnostic and therapeutic uses, in particular to the application of microRNAs 1468 5p, microRNAs 629 5p and their compositions in the preparation of osteoporosis diagnostic and therapeutic preparations. Through high throughput sequencing and bioinformatics analysis, the applicant found that microRNAs, fluorescent quantitative PCR and cell experiments related to osteoporosis were validated by molecular biology. The present invention provides a potential molecular marker for the accurate diagnosis of postmenopausal osteoporosis.

【技术实现步骤摘要】
骨质疏松特异性miRNA、组合物及其诊疗用途
本专利技术涉及分子生物学领域，具体的涉及骨质疏松相关的miRNA、组合物及其诊疗用途，更具体的涉及miR-1468-5p、miR-629-5p及其组合物在制备骨质疏松诊断和治疗制剂中的应用。
技术介绍
骨质疏松症是一种以低骨量和骨组织微结构破坏为特征，导致骨质脆性增加和易于骨折的代谢性骨病，可分为原发性和继发性两类，原发性者又可分为I型和II型两类，I型即绝经后骨质疏松，发生于绝经后女性；II型多见于60岁以上的老年人，女性的发病率是男性的2倍以上。随着全世界人口老年化的发展趋势，骨质疏松症患者群体将会愈发庞大，骨痛、骨折甚至丧失生活自理能力等骨质疏松并发症所带来的一些社会经济问题也愈专利技术显。研究骨质疏松症的发生发展、治疗预防等分子机理具有重要意义。MicroRNAs(miRNA)是一类短小(长度约为22个核苷酸)的非编码RNA分子，通过破坏mRNA的稳定结构或通过抑制翻译调节基因的表达而发挥作用。有报道显示miRNA参与成骨细胞的生成过程，也有一些miRNA促进破骨细胞的增殖和分化。申请人之前的研究发现有的miRNA和骨肉瘤密切相关并申请了相关专利，如ZL2016102726021、ZL2016102717978、ZL2016100658937，但是miRNA和骨质疏松的关系研究较少，有待进一步探索。本研究中，申请人通过高通量测序，并运用生物信息学方法进行分析，发现了几个之前从未被报道过的与骨质疏松相关的miRNA，其中，miR-1468-5p在患病组中表达低于对照组，miR-629-5p在患病组表达量高于对照组，进一步，荧光定量PCR实验结果验证了高通量测序的分析，表明miR-1468-5p、miR-629-5p很有可能成为新的绝经后骨质疏松诊断标志物，进一步通过细胞实验研究miR-1468-5p、miR-629-5p对成骨分化的影响，本专利技术为临床绝经后骨质疏松的精准诊断提供了潜在的分子标志物。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种骨质疏松诊断试剂，所述骨质疏松诊断试剂检测样本中miRNA和/或其前体的转录情况，或者miRNA调控的靶基因的表达，检测所述miRNA选自下列中的一种或几种：miR-1468-5p、miR-629-5p。优选的，所述miRNA为miR-629-5p和/或miR-1468-5p的组合。所述miR-1468-5p序列见序列表SEQIDNO1，其前体mir-1468序列见序列表SEQIDNO2；所述miR-629-5p序列见序列表SEQIDNO3，其前体miR-629-5p序列见序列表SEQIDNO4。所述骨质疏松为绝经后骨质疏松。所述的样本为外周血。进一步，骨质疏松诊断试剂采用高通量测序方法和/或定量PCR方法和/或基于探针杂交方法检测样本中miRNA和/或其前体的转录或基于免疫方法检测样本中其成熟miRNA调控的靶基因的表达情况。优选采用northern杂交方法、miRNA表达谱芯片、核酶保护分析技术、RAKE法、原位杂交、基于微球的流式细胞术检测样本中miRNA和/或其前体的转录。优选的，所述的用于定量PCR方法包括特异性扩增miRNA和/或其前体的引物；所述的基于探针杂交方法包括与miRNA和/或其前体的核酸序列杂交的探针。进一步，扩增miR-1468-5p的引物为序列SEQIDNO5；扩增miR-629-5p的引物为序列SEQIDNO6。miR-1468-5p调控的靶基因为DERL2、MTRNR2L3、MTRNR2L8、MTRNR2L6、MTRNR2L9、SEMA3D、BRIX1、SATB2、SRSF2、C12orf73、MMAB、PLXDC1、LYRM7、RPL27A、SYK、PSORS1C2、AKR1A1。miR-629-5p调控的靶基因为HNF4A、HIST1H2AC、ATP5G2、ZCCHC6、TP53INP2、PERP、CFLAR、RASSF8、TNFRSF10D、PTPRB、CARD8、RAB12、ZEB1、AKTIP、ZBTB18、HOXC8、ZBTB47、SDCBP、TFDP1、PAPD7、OR2A4、RSRC2、IRF2BP2、EIF1AD、RTKN、HOXB13、HIST1H1C、TXNIP、HIST1H3B、HIST1H3D、HIST1H2BH、HIST1H2BE、HIST1H2BB、CSNK1E、RAB3B、DMXL1、GPR82、DYRK2、AAK1、RAB3IP、SYNGAP1、RIOK3、SIX1、SGCD、ZNF175、ERAP2、CMBL、ERGIC2、PARD3、DHFR2、PTPN14、NFYA、MTRF1L、TRIM33、AGAP1、ELF3、GPR107、ONECUT3、ZBTB7A、ANO8、MIEF1、NCDN。本专利技术的目的还在于提供上述miRNA和/或其前体在制备骨质疏松诊断工具中的应用。优选的，骨质疏松为绝经后骨质疏松。本专利技术的目的在于提供一种药物组合物，所述药物组合物包含：(a)化合物或组合物，所述化合物下调miR-629-5p的转录和/或抑制miR-629-5p成熟miRNA的活性；(b)药剂学上能接受的载体。进一步，采用反义寡核苷酸、antagomiRs、miRNA海绵、miRNAErasers、TargetMasking和/或多靶点反义寡核苷酸的方法下调miR-629-5p或的转录和/或阻断miR-629-5p或的活性。本专利技术的目的在于提供一种药物组合物，所述药物组合物包含：(a)化合物或组合物，所述化合物上调miR-1468-5p的转录和/或促进miR-1468-5p成熟miRNA的活性；(b)药剂学上能接受的载体。进一步，采用基于RNA的microRNA功能获得性技术和/或基因特异性miRNAMimics技术上调miR-1468-5p的转录和/或促进其成熟miRNA的活性。优选的，通过人工合成miR-1468-5p模拟物或成熟miRNA的短发夹RNA(shorthairpinRNA，shRNA)或通过调控启动子上调miR-1468-5p。上述药物组合物在制备预防、治疗骨质疏松药物中的应用。优选的，骨质疏松为绝经后骨质疏松。定义：现阶段检测miRNA的表达水平的方法主要包括基于高通量测序技术、基于核苷酸杂交和基于PCR的miRNA检测方法。基于探针杂交技术的miRNA检测方法是一种直接检测法，不需要对样本RNA进行预扩增，包括northern杂交方法、miRNA表达谱芯片、核酶保护分析技术、RAKE法、原位杂交、基于微球的流式细胞术等技术。(1)Northern杂交又称RNA印迹技术为最经典的检测真核生物RNA大小，估计其丰度的实验方法。基本原理如下：首先在载体(如硅片、微球或膜等)上固定miRNA样本，再与经过标记的探针杂交，洗涤多余的杂交探针后进行信号检测；也可以在载体上先固定与靶miRNA序列互补的DNA探针，然后与经过标记的样本miRNA杂交，再进行信号检测。信号标记的方法包括同位素标记、荧光标记和纳米金标记等。(2)miRNA表达谱芯片原理同样是使用标记探针检测固相支持物上的目标分子。通过设计芯片上miRNA基因及内参序列，可精确分析出样品中相本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种骨质疏松诊断试剂，采用所述试剂检测样本中miRNA和/或其前体的转录或者检测样本miRNA调控的靶基因的表达，其特征在于，miRNA为miR‑1468‑5p和/或miR‑629‑5p。

【技术特征摘要】
1.一种骨质疏松诊断试剂，采用所述试剂检测样本中miRNA和/或其前体的转录或者检测样本miRNA调控的靶基因的表达，其特征在于，miRNA为miR-1468-5p和/或miR-629-5p。2.根据权利要求1所述的骨质疏松诊断试剂，其特征在于，采用高通量测序方法和/或定量PCR方法和/或探针杂交方法检测样本中miRNA和/或其前体的转录或采用免疫方法检测样本中其成熟miRNA调控的靶基因的表达情况。3.根据权利要求1所述的骨质疏松诊断试剂，其特征在于，采用northern杂交方法、miRNA表达谱芯片、核酶保护分析技术、RAKE法、原位杂交、基于微球的流式细胞术检测样本中miRNA和/或其前体的转录。4.根据权利要求2所述的骨质疏松诊断试剂，其特征在于，定量PCR包括特异性扩增miRNA和/或其前体的引物；探针杂交包括与miRNA和/或其前体的核酸序列杂交的探针，优选的，扩增miR-1468-5p的引物为序列SEQIDNO5；扩增miR-629-5p的引物为序列SEQIDNO6。5.根据权利要求1所述的骨质疏松诊断试剂，其特征在于，样本为外周血。6.权利要求1-5任意一项所述的骨质疏松诊断试剂...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨承刚，魏琳，高舒欣，
申请(专利权)人：固安博健生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：河北,13