人源OAT1-MRP2-UGT2B7三重稳定转染细胞株及其构建方法技术

本发明专利技术涉及一种人源OAT1‑MRP2‑UGT2B7三重稳定转染细胞株的构建方法及功能验证：将hOAT1的目的基因与pcDNA3.1/Hygro(+)表达载体组装，hMRP2的目的基因与pcDNA3.1/G418(+)表达载体组装，hUGT2B7的目的基因与pcDNA3.1/Puromycin(+)表达载体组装，构建pcDNA3.1/Hygro(+)‑hOAT1质粒、pcDNA3.1/G418(+)‑hMRP2质粒和pcDNA3.1/Puromycin(+)‑hUGT2B7质粒；其中，hOAT1、hMRP2和hUGT2B7目的基因的核苷酸序列分别如SEQ ID No.1‑3所示；采用脂质体法将构建的三种质粒依次转染至MDCKII细胞、Caco2细胞或HEK293细胞，分别使用特异抗生素筛选出阳性克隆，并通过使用阳性化合物进行转运或代谢功能验证，确认细胞株同时稳定表达OAT1、MRP2和UGT2B7基因及其蛋白。本发明专利技术的三重稳定转染细胞株可用于模拟肝内OAT1介导的摄取、MRP2介导的外排及UGT2B7介导的二相代谢功能，是评价药物处置机制的重要体外研究手段。

Triple stable transfection of human OAT1-MRP2-UGT2B7 cell line and its construction method

The present invention relates to the construction method and functional verification of a triple stable transfection cell line of human OAT1 MRP2 UGT2B7. The target gene of hOAT1 is assembled with pcDNA3.1/Hygro (+) expression vector, the target gene of hMRP2 is assembled with pcDNA3.1/G418 (+) expression vector, and the target gene of hUGT2B7 is assembled with pcDNA3.1/Puromycin (+) expression vector to construct pcDNA3.1/Hygro (+)hOAT1 plasmid and pcDNA3.1/G4.1/G4 expression vector. 18 (+) hMRP2 plasmid and pcDNA3.1/Puromycin (+) hUGT2B7 plasmid, in which the nucleotide sequences of hOAT1, hMRP2 and hUGT2B7 target genes were shown as SEQ ID No.1 3, respectively. The constructed plasmids were transfected into MDCKII cells, Caco2 cells or HEK293 cells by liposome method, respectively, and positive clones were screened by specific antibiotics and carried out by using positive compounds. Transport or metabolic function tests confirmed that the cell lines expressed OAT1, MRP2 and UGT2B7 genes and their proteins at the same time. The triple stable transfected cell line of the invention can be used to simulate intrahepatic uptake mediated by OAT1, efflux mediated by MRP2 and two-phase metabolic function mediated by UGT2B7, and is an important in vitro research means for evaluating drug disposal mechanism.

【技术实现步骤摘要】
人源OAT1-MRP2-UGT2B7三重稳定转染细胞株及其构建方法
本专利技术涉及细胞株构建领域，尤其涉及一种人源OAT1-MRP2-UGT2B7三重稳定转染细胞株构建方法及功能验证。
技术介绍
药物代谢转运是体内药物处置的关键因素，直接影响药物的安全性及治疗效果。随着生物技术的发展，建立体外高表达细胞模型日益成为研究药物处置机制、相互作用以及安全性的首选模型。目前已有报道的研究代谢转运的细胞模型包括Caco2细胞(人结直肠癌细胞系)、高表达转运体MDCKII细胞模型(如MDCKII-hOCTs、MDCKII-hOATPs、MDCKII-hMDR1、MDCKII-hBCRP、MDCKII-MRP2、MDCKII-hMDR1-hBCRP等)以及HEK293细胞模型(如HEK293-OATP1A2、HEK293-OATP1B1、HEK293-OCT等)。这些细胞模型的建立为阐明药物代谢机制、研究代谢酶和转运体间的相互作用提供了可能。近年来，通过建立细胞培养模型来研究药物处置机制是药物研发进程中取得的重要突破与成就。应用细胞模型可以研究候选化合物或者临床用药的转运机制、代谢、药物药物相互作用、毒性以及安全性评估等。细胞模型方法具有所需的药物量少、实验方法简单、分析迅速、环境条件可控(温度、pH等)等优势，能够快速获得药物透膜的转运机制，可以达到体外高通量筛选的目的。在药物处置及相互作用机制研究中，稳定转染的细胞株是重要的研究技术。目前，缺乏一种OAT1-MRP2-UGT2B7稳定转染细胞株。
技术实现思路
为解决上述技术问题，本专利技术的目的是提供一种人源OAT1-MRP2-UGT2B7三重稳定转染细胞株及其构建方法，为后续药物的跨膜转运机制研究工作提供技术平台。本专利技术的第一个目的是提供一种人源OAT1-MRP2-UGT2B7三重稳定转染细胞株的构建方法，包括以下步骤：(1)将hOAT1的目的基因与pcDNA3.1/Hygro(+)表达载体组装，hMRP2的目的基因与pcDNA3.1/G418(+)表达载体组装，hUGT2B7的目的基因与pcDNA3.1/Puromycin(+)表达载体组装，构建pcDNA3.1/Hygro(+)-hOAT1质粒、pcDNA3.1/G418(+)-hMRP2质粒和pcDNA3.1/Puromycin(+)-hUGT2B7质粒；其中，hOAT1、hMRP2和hUGT2B7目的基因的核苷酸序列分别如SEQIDNo.1-3所示；(2)采用脂质体法将步骤(1)构建的三种质粒依次转染至MDCKII细胞、Caco2细胞或HEK293细胞，细胞转染24h后，分别使用特异性抗生素筛选出阳性克隆，并通过使用阳性化合物进行转运或代谢功能验证，确认细胞株同时稳定表达OAT1、MRP2和UGT2B7基因及其蛋白，即构建出所述人源OAT1-MRP2-UGT2B7三重稳定转染细胞株，其中，所述抗生素为G418抗生素、hygromycinB抗生素和Puromycin抗生素。进一步地，在步骤(1)中，采用合成生物学方法，合成hOAT1、hMRP2和hUGT2B7目的基因。与传统的基因克隆技术相比，合成生物学具有快速、准确、高效等特点，在构建基因表达体系时更具有优势。进一步地，在步骤(1)中，构建质粒时所采用的内切酶为NheI和KpnI限制性内切酶或NheI和HindIII限制性内切酶。在步骤(2)中，相比于物理转染法费时费力、效率不高，化学转染法中人工脂质体法具有较高的转染效率，可以转染其他方法不易转染的细胞系，DNA质粒、干扰小RNA(microRNA、shRNA等)甚至是蛋白都可以通过脂质体法进行转染。此外，脂质体转染法同时适用于瞬时表达和稳定表达，前者具有快速、灵活的特点，后者具有稳定、重现性强等优势。进一步地，在步骤(2)中，质粒转染时，三种质粒的浓度为0.001μg/μL。进一步地，在步骤(2)中，G418抗生素的浓度为800μg/mL，hygromycinB(潮霉素B)抗生素的浓度为400μg/mL，Puromycin(嘌呤霉素)抗生素的浓度为5μg/mL。以上浓度下，不含相应抗性的细胞2天左右死亡60％，而含相关抗性的细胞原则上不会死亡。浓度过高会杀死含抗性细胞，且长期培养细胞形态易改变。进一步地，在步骤(2)中，取对数生长期的细胞进行细胞转染。进一步地，在步骤(2)中，抗生素筛选时，细胞融合度超过25％时，立即传代，每3-4天更换含特定浓度抗生素的培养液进行培养，重复以上步骤，直至传代至3-4代，挑选出阳性单克隆继续培养至长成细胞株。进一步地，在步骤(2)中，质粒转染所用培养基为无血清的DEME培养基。进一步地，在步骤(2)中，采用PolyJet转染试剂进行质粒转染。进一步地，在步骤(2)中，从mRNA、蛋白表达以及功能三方面进行验证，以筛选出稳定表达hOAT1、hMRP2、hUGT2B7三个基因，且具有活性的阳性克隆细胞株。进一步地，在步骤(2)中，转染细胞优选为MDCKII细胞。MDCKII为犬肾上皮细胞，与人正常细胞的生理特征接近。培养后可分化成极性的柱状上皮并形成刷状缘，相邻细胞间紧密连接，形成完整的细胞单层，对物质的通透性低。生化特性检查发现MDCKII中缺乏大部分的代谢酶、摄取转运体和外排转运体。因此，MDCKII细胞具有培养周期短、背景较低、易于培养等优点，稳定转染的MDCKII细胞株是药物代谢转运研究的有效手段。进一步地，转染试剂的用量为40μL每100μL培养基。本专利技术的第二个目的是要求保护一种采用上述方法所构建的人源OAT1-MRP2-UGT2B7三重稳定转染细胞株，该细胞株可同时稳定表达OAT1、MRP2和UGT2B7基因及其蛋白，并具有相对应的转运与代谢功能。本专利技术描述的三重稳定转染细胞株可用于模拟肝内OAT1介导的摄取、MRP2介导的外排及UGT2B7介导的二相代谢功能，是评价药物处置机制的重要体外研究手段。借由上述方案，本专利技术至少具有以下优点：本专利技术通过目的基因合成技术，成功完成了hOAT1-hMRP2-hUGT2B7三重稳定转染细胞株构建，为后续药物的跨膜转运及代谢机制研究工作奠定基础。本专利技术快速、准确、高效的构建基因表达体系，转染方法稳定、重现性强。上述说明仅是本专利技术技术方案的概述，为了能够更清楚了解本专利技术的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本专利技术的较佳实施例并配合附图详细说明如后。附图说明图1是本专利技术hMRP2在mRNA水平上的表达情况测试结果；图2是本专利技术UGT2B介导的Steviol代谢物SV-G在单克隆细胞株的外排率测试结果。具体实施方式下面结合附图和实施例，对本专利技术的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的范围。实施例1质粒的构建利用合成生物学方法，通过基因合成得到hOAT1、hMRP2、hUGT2B7目的基因，其中，hOAT1、hMRP2和hUGT2B7目的基因的核苷酸序列分别如SEQIDNo.1、SEQIDNo.2、SEQIDNo.3所示。将上述三种基因分别与pcDNA3.1/Hygro(+)、pcDNA3.1/G418(+)、pcDNA3.1/Puromycin(+)表达载体连接，转化扩增后，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种人源OAT1‑MRP2‑UGT2B7三重稳定转染细胞株的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将hOAT1的目的基因与pcDNA3.1/Hygro(+)表达载体组装，hMRP2的目的基因与pcDNA3.1/G418(+)表达载体组装，hUGT2B7的目的基因与pcDNA3.1/Puromycin(+)表达载体组装，构建pcDNA3.1/Hygro(+)‑hOAT1质粒、pcDNA3.1/G418(+)‑hMRP2质粒和pcDNA3.1/Puromycin(+)‑hUGT2B7质粒；其中，hOAT1、hMRP2和hUGT2B7目的基因的核苷酸序列分别如SEQ ID No.1‑3所示；(2)采用脂质体法将步骤(1)构建的三种质粒依次转染至MDCKII细胞、Caco2细胞或HEK293细胞，细胞转染24h后，用抗生素筛选出阳性克隆，构建出所述人源OAT1‑MRP2‑UGT2B7三重稳定转染细胞株，其中，所述抗生素为G418、潮霉素B和嘌呤霉素。

【技术特征摘要】
1.一种人源OAT1-MRP2-UGT2B7三重稳定转染细胞株的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将hOAT1的目的基因与pcDNA3.1/Hygro(+)表达载体组装，hMRP2的目的基因与pcDNA3.1/G418(+)表达载体组装，hUGT2B7的目的基因与pcDNA3.1/Puromycin(+)表达载体组装，构建pcDNA3.1/Hygro(+)-hOAT1质粒、pcDNA3.1/G418(+)-hMRP2质粒和pcDNA3.1/Puromycin(+)-hUGT2B7质粒；其中，hOAT1、hMRP2和hUGT2B7目的基因的核苷酸序列分别如SEQIDNo.1-3所示；(2)采用脂质体法将步骤(1)构建的三种质粒依次转染至MDCKII细胞、Caco2细胞或HEK293细胞，细胞转染24h后，用抗生素筛选出阳性克隆，构建出所述人源OAT1-MRP2-UGT2B7三重稳定转染细胞株，其中，所述抗生素为G418、潮霉素B和嘌呤霉素。2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于：在步骤(1)中，构建质粒时所采用的内切酶为NheⅠ和KpnⅠ限制性内切酶或NheⅠ和HindⅢ限制性内切酶。3.根据权利要求1所述的构建方法，...

【专利技术属性】
技术研发人员：张洪建，王美玉，
申请(专利权)人：苏州大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32