一种同时分析短链、中链和长链酰基辅酶A的方法技术

本发明专利技术涉及一种同时分析短链、中链和长链酰基辅酶A的在线二维液相色谱‑质谱轮廓分析方法。其特征在于：采用甲醇‑氯仿‑水双相提取体系，提取样本中的酰基辅酶A。随后使用现有的二维液相色谱‑质谱联用系统在30分钟内实现短链、中链和长链酰基辅酶A的定性、定量分析。酰基辅酶A提取物经自动进样器进样后，首先通过第一维分析将具有不同链长的酰基辅酶A分离成性质不同的两个馏分，并在线转移至分别针对短链酰基辅酶A和中链、长链酰基辅酶A的平行柱分析系统，实现一次进样同时有效的分离短链、中链和长链酰基辅酶A。本发明专利技术方法简便、快速、易于操作，具有覆盖度广、通量高、重复性好等优势。

A Method for Simultaneous Analysis of Short Chain, Medium Chain and Long Chain Acyl CoA

The present invention relates to an on-line two-dimensional liquid chromatography mass spectrometry profile analysis method for simultaneous analysis of short, medium and long chain acyl coenzyme A. The method is characterized in that the acyl coenzyme A in the sample is extracted by methanol, chloroform and water two-phase extraction system. Subsequently, qualitative and quantitative analysis of short, medium and long chain acyl coenzyme A was achieved within 30 minutes using the existing two-dimensional liquid chromatography-mass spectrometry system. After the acyl coenzyme A extract was injected into the automatic sampler, the acyl coenzyme A with different chain length was separated into two distillates with different properties by first-dimensional analysis, and transferred online to parallel column analysis system for short-chain acyl coenzyme A and medium-chain acyl coenzyme A, respectively. The short-chain, medium-chain and long-chain acyl coenzyme A could be effectively separated by one-time injection. The method of the invention is simple, fast and easy to operate, and has the advantages of wide coverage, high flux and good repeatability.

【技术实现步骤摘要】
一种同时分析短链、中链和长链酰基辅酶A的方法
本专利技术属于一种液相色谱分析方法，具体涉及一种同时分析短链、中链和长链酰基辅酶A的在线二维液相色谱-质谱轮廓分析方法。
技术介绍
酰基辅酶A是一类由脂肪酸和游离辅酶A形成的脂肪酸硫脂，在脂质合成、脂肪酸氧化、氨基酸代谢、酮体合成等许多代谢通路和生化过程中起着非常重要的作用。乙酰辅酶A多由糖代谢或脂肪酸代谢产生，其可进入三羧酸循环进一步氧化成二氧化碳和水，为机体提供能量。此外，乙酰辅酶A也是合成酮体、脂质、胆固醇等能源性或其他生理活性物质的前体物质。与乙酰辅酶A类似，其他酰基辅酶A同样参与许多复杂的生物过程，传递脂肪酸链进行表观遗传修饰。机体内酰基辅酶A的异常调节与癌症、肥胖、糖尿病等多种疾病的发生发展密切相关，对它们进行定性、定量分析是非常有意义的。由于酰基辅酶A分子中存在腺苷基团，早期的分析多使用液相色谱(LC)-紫外检测方法。但是，紫外检测器灵敏度和分辨率不足。气相色谱(GC)-质谱(MS)方法同样可以用于酰基辅酶A的分析，但是复杂的衍生化步骤费时费力。因反相液相色谱(RPLC)-MS技术具有较好的分离性能和较高的灵敏度，这种技术已广泛用于酰基辅酶A的分离分析。由于性质差别较大，具有不同链长的酰基辅酶A需要不同的LC条件以得到最佳的分离效果。短链和中链酰基辅酶A具有较强的极性，为了增强其在RPLC色谱柱上的保留，使用弱酸性流动相条件或者离子对试剂是两种常用的策略。但是在这种条件下，长链酰基辅酶A因保留过强而导致色谱峰严重拖尾，此外，离子对试剂对MS造成严重污染。长链酰基辅酶A多使用强碱性流动相条件进行分析，在该条件下酰基辅酶A分子脱质子化，从而减弱在RPLC色谱柱上的保留，进而避免色谱峰拖尾。综上所述，使用传统RPLC条件，单一方法仅能较好的覆盖并分离部分链长的酰基辅酶A，若想获得全部的酰基辅酶A轮廓信息，需进行两次分析。针对常规酰基辅酶A分析方法存在的问题，本专利技术发展了一种可同时覆盖并良好分离短链、中链和长链酰基辅酶A的在线二维液相色谱-质谱方法。首先在第一维使用预分离柱将生物样品提取物分离成短链酰基辅酶A和中链、长链酰基辅酶A两个馏分，随后在线转移至第二维平行柱分离系统。依据各馏分的性质，分别使用弱碱性和强碱性流动相条件分离短链酰基辅酶A和中链、长链酰基辅酶A。本专利技术所建立的方法对酰基辅酶A的覆盖度广、分离度好、灵敏度高，适合用于组织、细胞等生物样本中酰基辅酶A的高效分离。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有分析方法的不足，提供一种基于二维液相色谱-质谱技术的酰基辅酶A轮廓分析方法，可显著提高方法的覆盖度，用于短链、中链和长链酰基辅酶A的同时分析。为实现上述目的，本专利技术采用的具体技术方案如下：第一步：准确称取新鲜肝脏组织10-20mg并加入250-500μL甲醇，涡旋30-60秒，加入250-500μL氯仿，涡旋30-60秒，加入100-200μL水，涡旋30-60秒。第二步：在12000-15000rpm，0-4℃的条件下离心10-20分钟后，移取200-450μL上层清液，并将上层清夜在0-4℃条件下冷冻干燥。第三步：使用50-100μL甲醇/水(1:4-1:6，v:v)溶液将冻干的酰基辅酶A提取物复溶。第四步：使用在线二维液相色谱-质谱系统同时分析短链、中链和长链酰基辅酶A。第一维分离旨在实现短链酰基辅酶A和中链、长链酰基辅酶A的分离，得到两个馏分。所用色谱柱为C18色谱柱(2.1×5mm,1.7μm)。使用弱碱性条件分析短链酰基辅酶A，流动相A1为水，其中含有10-20mM甲酸铵和0.05-0.1wt.％氨水，流动相B1为乙腈/水(95:5，v:v)，其中含有10-20mM甲酸铵和0.05-0.1wt.％氨水。选择C6:0-酰基辅酶A作为两个馏分的边界。第二维为平行柱分析系统，旨在实现短链酰基辅酶A馏分和中链、长链酰基辅酶A馏分的精细分离分析。分离短链酰基辅酶A所使用的液相色谱仪器和流动相条件与第一维色谱分离系统相同，所使用的第二维色谱柱1为T3柱(2.1×50mm,1.7μm)。使用强碱性条件分析中链和长链酰基辅酶A，流动相A2为水，其中含有0.2-0.6wt.％氨水，流动相B2为乙腈，其中含有0.2-0.6wt.％氨水。分离过程采用梯度洗脱，其中流动相B1从3％升至100％，B2从10％升至100％。色谱柱温均为35℃，进样体积为5μL。所述的在线二维液相色谱-质谱分析系统，采用的装置包括液相色谱泵1、液相色谱泵2、稀释液泵、自动进样器、第二维液相色谱柱1、第二维液相色谱柱2、第一维液相色谱柱、十通阀、八通阀、六通阀、和检测器。其分离过程包括馏分分离、短链酰基辅酶A分析、中链和长链酰基辅酶A分析、溶剂替换四个步骤，具体如下：初始时，八通阀的3号位与4号位相连，十通阀的15号位与16号位相连，六通阀的28号位与33号位相连；液相色谱泵1的输出端经过自动进样器与八通阀的3号位相连，八通阀的4号位通过管线与十通阀的15号位相连，十通阀的16号位与第一维液相色谱柱的输入端相连，第一维液相色谱柱的输出端与十通阀的19号位相连，十通阀的20号位通过管线与八通阀的9号位相连，八通阀的10号位与第二维液相色谱柱1的输入端相连，第二维液相色谱柱1的输出端与六通阀的28号位相连，六通阀的33号位与检测器相连；液相色谱泵2与八通阀的5号位相连，八通阀的6号位和7号位通过管线相连，8号位与第二维液相色谱柱2的输入端相连，第二维液相色谱柱2的输出端与六通阀的32号位相连，六通阀的30号位与31号位通过管线相连，29号位接入废液；在该位置，自动进样器将酰基辅酶A提取液进样到第一维液相色谱柱，短链酰基辅酶A首先流出并转移至第二维液相色谱柱1中；待C6:0-酰基辅酶A从第一维液相色谱柱完全流出后，控制十通阀切换，十通阀的15号位与24号位相连，十通阀的24号位通过管线与21号位相连，十通阀的22号位和23号位堵死；在该位置实现短链酰基辅酶A在第二维液相色谱柱1中的分离以及第二维液相色谱柱2的平衡；待短链酰基辅酶A在第二维液相色谱柱1中分离完成后，控制十通阀、八通阀、和六通阀同时切换，在该位置，第一维液相色谱柱(26)中的中链和长链酰基辅酶A馏分转移到第二维液相色谱柱2中并进行分离；与此同时，完成第二维液相色谱柱1的平衡；待中链和长链酰基辅酶A分离完成后，控制十通阀切换；稀释液泵与十通阀的17号位相连，十通阀的16号位与第一维液相色谱柱(26)的输入端相连，第一维液相色谱柱(26)的输出端与十通阀的19号位相连，十通阀的18号位接入废液；在该位置，实现第一维液相色谱柱中残留溶剂的替换。本专利技术的核心过程是：使用在线二维液相色谱分离系统，在第一维实现不同极性酰基辅酶A的馏分分离，进一步结合第二维的超高效液相色谱平行柱分析系统，实现短链、中链和长链酰基辅酶A的同时覆盖。与传统方法相比本专利技术具有如下优点：本专利技术方法覆盖度广，可实现同时分离分析短链、中链和长链酰基辅酶A。不同链长酰基辅酶A均在最优条件下分析，分离度高。分析通量高，一次进样即可实现酰基辅酶A轮廓信息的全覆盖，缩短了分析时间。此外，本专利技术方法操作简便，灵敏度高，样本用量少，普适性强。附图说明图1为本专利技术提供本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种同时分析短链、中链和长链酰基辅酶A的方法，其特征在于：第一步：使用甲醇‑氯仿‑水双相体系提取新鲜生物组织中的酰基辅酶A，其中甲醇、氯仿和水的体积比为2.5:2.5:1；第二步：离心后，移取上层清液，并将上层清夜冷冻干燥；第三步：使用甲醇‑水的混合溶剂作为复溶溶剂将冻干提取物溶解；第四步：使用在线二维液相色谱‑质谱系统同时分析短链、中链和长链酰基辅酶A。

【技术特征摘要】
1.一种同时分析短链、中链和长链酰基辅酶A的方法，其特征在于：第一步：使用甲醇-氯仿-水双相体系提取新鲜生物组织中的酰基辅酶A，其中甲醇、氯仿和水的体积比为2.5:2.5:1；第二步：离心后，移取上层清液，并将上层清夜冷冻干燥；第三步：使用甲醇-水的混合溶剂作为复溶溶剂将冻干提取物溶解；第四步：使用在线二维液相色谱-质谱系统同时分析短链、中链和长链酰基辅酶A。2.按照权利要求1所述的酰基辅酶A分析方法，其特征在于：第一步中所用的新鲜生物组织为10-20mg；加入甲醇250-500μL并涡旋30-60秒，随后加入氯仿250-500μL并涡旋30-60秒，加入水100-200μL并涡旋30-60秒。3.按照权利要求1所述的酰基辅酶A分析方法，其特征在于：第二步中使用12000-15000rpm，0-4℃的条件下离心10-20分钟后，移取200-450μL上层清液，在0-4℃条件下冷冻干燥。4.按照权利要求1所述的酰基辅酶A分析方法，其特征在于：第三步使用50-100μL复溶溶剂复溶，复溶溶剂为甲醇与水体积比＝1:4-1:6。5.按照权利要求1所述的酰基辅酶A分析方法，其特征在于：第四步使用弱碱性条件分析短链酰基辅酶A，流动相A1为水，其中含有终浓度10-20mM甲酸铵和0.05-0.1wt.％氨水，流动相B1为乙腈/水(95:5，v:v)，其中含有终浓度10-20mM甲酸铵和0.05-0.1wt.％氨水；使用强碱性条件分析中链和长链酰基辅酶A，流动相A2为水，其中含有终浓度0.2-0.6wt.％氨水，流动相B2为乙腈，其中含有终浓度0.2-0.6wt.％氨水；分离过程采用梯度洗脱，其中流动相B1从3％升至100％，B2从10％升至100％。6.按照权利要求1或5所述的酰基辅酶A分析方法，其特征在于：在线二维液相色谱-质谱分析系统使用C18色谱柱作为第一维预分离柱，旨在将短链酰基辅酶A和中链、长链酰基辅酶A分离，得到两个馏分；选择C6:0-酰基辅酶A作为两个馏分的边界；定义在C6:0-酰基辅酶A之前流出的为短链酰基辅酶A，在C6:0-酰基辅酶A与C12:0-酰基辅酶A之间流出的为中链酰基辅酶A，在C12:0-酰基辅酶A之后流出的为长链酰基辅酶A；第二维为平行柱分析系统，使用T3色谱柱分离短链酰基辅酶A，使用C18色谱柱分离中链和长链酰基辅酶A。7.按照权利要求1所述的酰基辅酶A分析方法，其特征在于：新鲜生物组织为新鲜肝脏组织样本、脑组织样本、心脏组织样本、肾脏组织样本或细胞样本中的一种或二种以上。8.按照权利要求1所述的酰基辅酶A分析方法，其特征在于：所述的在线二维液相色谱-质谱分析系统，采用的装置包括液相色谱泵1(1)、液相色谱泵2(14)、稀释液泵(27)、自动...

【专利技术属性】
技术研发人员：许国旺，王霜原，石先哲，周丽娜，
申请(专利权)人：中国科学院大连化学物理研究所，
类型：发明
国别省市：辽宁,21